本发明专利技术属于生化分离技术领域。本发明专利技术所要解决的技术问题在于公开一种从生物转化或多酶反应液中分离ＣＤＰ－Ｃ的方法，以克服现有技术中存在的ＣＤＰ－Ｃ回收率低和胞苷酸无法回收的技术缺陷。本发明专利技术的技术方案是将ＣＤＰ－Ｃ反应液依次通过阳离子交换柱１、阴离子交换柱２和阴离子交换柱３；用去离子水洗涤柱１－３；用ｐＨ５．０的溶液串洗阴离子交换柱２和阴离子交换柱３；用高浓度的盐和盐酸浓液将ＣＤＰ－Ｃ从阴离子交换柱３上洗脱得到高纯度的ＣＤＰ－Ｃ溶液；用ｐＨ３．０的溶液洗脱阴离子交换柱２上吸附的ＣＭＰ。本发明专利技术的方法分离时间缩短，水耗量降低６０％以上，产品容易结晶，可高收率的获得ＣＤＰ－Ｃ产品，并可回收大部分未反应完的ＣＭＰ。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种胞二磷胆碱的分离纯化方法。尤其是从生物转化或多酶反 应液中，采用新型离子交换树脂组合柱层析，分离纯化胞二磷胆碱的方法。
技术介绍
胞二磷胆碱(cytidine diphosphate choline,简称CDP-Choline， CDP-C)是 机体卵磷脂合成的重要中间体，是磷脂代谢所必需的辅酶。在临床上，CDP-C 在脑中磷脂代谢受损的状态下可以改善磷脂的代谢，从而促进意识的恢复。对 脑外伤、脑手术所致的意识障碍，以及对一些慢性病如脑卒中后遗症、帕金森 氏病、中枢性眩晕、耳鸣、青光眼和感觉性神经耳聋有一定的疗效。CDP—C可用化学合成和生物合成制备。化学合成CDP-C通常需要制备一 些中间体(如胞苷酸吗啡胍盐或胞嘧啶二磷酸二酚等)，工艺烦琐；虽然Kennedy 曾采用加入大量的二环己基羰基二亚胺(DCC)PH乍縮合剂直接縮合胞苷酸 (CMP)和磷酸胆碱来制备CDP-C(KennedyE.P.,J.Biol.Chem, 1956,222:185)，但 DCC试剂价格昂贵，用于工业生成成本过高；Ki:kugawa[叫(Kikugawa， Chem. Pharmaceut.BuU, 1971,19:1011)和上海实验生物研究所(海实验生物研究所核酸研 究组，生物化学与生物物理进展，1975，1:19)曾采用对甲苯磺酰氯代替DCC作縮 合剂直接縮合CMP和磷酸胆碱来制备CDP-C，但仍存在着操作要求严格和转化 率不高等问题。利用生物体内的相关酶系进行生物法合成，具有反应条件温和、转化率高 、成本低等特点，因此近年CDP-C的生产大多都采用生物合成。生物合成中，以CMP与磷酸胆碱(盐)为底物生物合成CDP-C最为成熟。如文献给出了利用酵母生物转化合成CDP-C的生产条件pH8.0， 20mmol/LCMP, 酵母550g/L，磷酸盐缓冲液为200mmol/L，葡萄糖1000mmol/L,磷酸胆碱 卯mmol/L，硫酸镁20mmol/L，反应时间在24-32小时，反应温度在28°C， CDP-C 转化率可达80%以上(生物化学与生物物理进展，1977, (4): 15-19)。生物合成的CDP-C反应液中，含有蛋白质，色素，未反应完的磷酸盐，磷 酸胆碱，硫酸镁，胞苷酸，以及葡萄糖代谢副产物和胞苷等物质，这使CDP-C 的分离纯化带来很多困难。CDP-C的分离提取先要经过离心去除菌体，调酸、调碱去除蛋白；然后活 性炭吸附洗脱；离子交换树脂吸附，分部洗脱等步骤， 一般回收率不超过40%， 在工业生产中损耗严重(生物化学与生物物理学报，1976, 8(3): 199-205;黄颖，医 药工业,1985, 16(1): 3-5)。另外价格较贵的未反应完的胞苷酸无法回收。
技术实现思路
本专利技术需要解决的问题在于公开一种组合柱层析法从生物转化或多酶反应 液(以下简称反应液)中分离CDP-C的方法，以克服现有技术的缺陷，并适用 于工业规模生产。本专利技术的构思是这样的本专利技术采用新型离子交换树脂组合层析法(图1)。 1#阳柱吸附中的色素， 蛋白质，胞苷，调节pH; 2#阴柱分离CDP-C和CMP; 3，柱浓縮CDP-C溶液。 1#阳柱可采用大孔酚醛系弱酸树脂(HD-1)。该树脂可吸附大分子物质，如 蛋白质等，亦可交换去除阳离子，如钙、镁离子及胞苷，这样可以保护后续分 离不受这些物质的干扰，增加后续柱的吸附量。同时还可以吸附去掉大部分的 色素，改变反应液的pH为酸性。2#阴柱可采用大孔弱碱性苯乙烯阴离子交换树脂如D301或多孔结构的酚醛 縮聚型弱碱性阴树脂如D345或大孔弱碱丙烯酸系阴离子交换树脂如D315等。 由于CDP-C所带负电荷要小于CMP，通过控制pH值可将两者在柱上分离，即 CMP吸附到树脂，而CDP-C流出。同时大部分阴离子可被吸附到此柱上。3#阴柱可采用强碱凝胶型阴离子交换树脂，如华东理工大学HZ201或其 它厂家生产的201x7， 201x8等，粒径在0.5-1.Omm之间。CDP-C可在此柱上得 到浓縮，减少后续真空浓縮操作能耗。本专利技术的特征是，通过新型阴阳离子交换树脂的有序组合层析，可一次性 分离纯化得到高纯度的CDP-C，与老工艺相比，柱分离时间縮短，水耗量降低6 0%以上，产品容易结晶。本专利技术的方法依次包括如下步骤1) 将过滤后CDP-C反应液依次通过1、 2、 3#柱，使蛋白质、色素、阳离 子吸附在1#柱中，阴离子和CMP及少量CDP-C吸附在2#柱中，大量CDP-C吸 附在3#柱中。2) 用去离子水洗涤1-3#柱，使P柱出口不再含CMP。3) 用pH5.0的溶液串洗2-3#柱，使2#柱出口不再含有CDP-C。4) 用高浓度的盐和盐酸浓液将CDP-C从3#柱上洗脱，即可得到高纯度的C DP-C溶液。5) 用pH3.0的溶液洗脱2#柱上吸附的CMP。通过上述分离过程，可高收率的获得CDP-C产品，并可回收大部分未反应 完的CMP,而其它副产物杂质都被柱所吸收或被洗脱时洗掉。本专利技术所用的方法具有操作简便，产品回率高，分离效果好，所得产品质 量优异，适合大规模工业生产等特点。附图说明图1为流程图。由图1所示本专利技术所说的方法依次包括如下步骤，1) 将CDP-C反应液过滤后，依次通过1#弱酸型阳离子交换树脂柱，2#弱碱 型阴离交换树脂和3#强碱型阴离子交换树脂。上柱总量为"柱总交换量的5-30%(摩尔比)，最佳为10-15%，即每30升树脂可交换1公斤胞二磷胆碱反应液。 柱l:柱2:柱3体积比为1: 1.2-2.5:0.3-0.8，最佳为1: 1.4-1.8: 0.5-0.7。 上柱的线速度为0.11-0.45米/小时，最佳为0.25-0.35米/小时。 上柱液中CDP-C的含量为l-20mg/mL，最佳为5-10mg/mL。 上柱完毕，用去离子水充分淋洗，使1#柱出口不含胞苷酸为止。2) 用pH5.0的溶液淋洗2#柱，使2#柱的出口不含CDP-C为止。然后改用p H3.0的溶液洗脱2"主，回收含CMP部分，经浓縮结晶得到CMP。3) 用高浓度的盐、酸混合溶液洗脱3#柱，所用的盐可以为可溶性的钠盐或 钾盐，本专利技术采用氯化钠溶液，浓度为0.5-10%，最佳为3-5%。所用的酸溶液可以硫酸，盐酸，磷酸等。本专利技术采用的稀盐酸溶液，浓度 为0.9-0.00001mol/L，最佳为0.1-0.001mol/L之间。得到的CDP-C溶液经浓縮后，加入3-5倍体积的乙醇，结晶，即可得到纯 度和含量都在98%以上的产品。本专利技术所说的1#柱所用树脂为大孔酚醛系弱酸树脂，如HD-l, 122， 125 等，粒径在5-30目，最佳在10-20目；所说的2#柱所用树脂为大孔弱碱性苯乙 烯阴离子交换树脂如D301或孔结构的酚醛縮聚型弱碱性阴树脂如D345或大孔 弱碱丙烯酸系阴离子交换树脂如D315等，粒径在在5-30目，最佳在10-20目；所说的3#柱可采用强碱凝胶型阴离子交换树脂，如HZ201、 201x7， 201x8， Am berlitelRA-900等，粒径在60-150目之间，最佳为80-100目之间。 分析检测方法钙镁离子采用铬黑T指示剂。蛋白质采用考马斯亮蓝显色法测定。 CDP-C和CMP采用HP本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种从生物转化或多酶反应液中分离纯化胞二磷胆碱的方法，包括如下步骤：１）将ＣＤＰ－Ｃ反应液依次通过阳离子交换柱１、阴离子交换柱２和阴离子交换柱３；２）用去离子水洗涤柱１－３，使阳离子交换柱１出口不再含ＣＭＰ；３）用ｐＨ５．０的溶液串洗阴离子交换柱２和阴离子交换柱３，使阴离子交换柱２出口不再含有ＣＤＰ－Ｃ；４）用高浓度的盐和盐酸浓液将ＣＤＰ－Ｃ从阴离子交换柱３上洗脱，即可得到高纯度的ＣＤＰ－Ｃ溶液；和，５）用ｐＨ３．０的溶液洗脱阴离子交换柱２上吸附的ＣＭＰ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邱蔚然，闫蓬勃，丁庆豹，
申请(专利权)人：南通秋之友生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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