一种用于microRNAs检测的电化学方法技术

一种用于microRNAs检测的电化学方法，包括以下步骤：A：纳米银溶液的制备：B：工作电极的制备，包括子步骤：B1：在玻碳电极表面电沉积金纳米粒子；B2：在B1所制得的电极表面组装巯基化的DNA捕获探针：5'‑TGACTTCAACATCAGTCTGATAAGCTAAGTCAT‑(CH2)6‑SH‑3'；B3：采用6‑巯基己醇封闭B2所制得的电极未反应的金表面；B4：将microRNAs修饰到骤B3得到的电极表面；B5：将4‑巯基苯硼酸和A得到的纳米银溶液混合物修饰到步骤B4得到的电极表面；C：电化学测试：将B制备得到的电极作为进行工作电极进行电化学测试；本方法操作简单，成本低，灵敏度高、测试准确。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种microRNAs的检测方法，特别涉及一种用于microRNAs检测的电化学方法，属于化学领域。
技术介绍
癌症是威胁全球人类生命的最大杀手之一,是当前医学研究领域所面临的一个重大挑战。我国每年癌症的发病人数约为200万，死于癌症的人数超过140万，且发病率一直呈上升趋势。癌症标志物是反映癌症的化学物质，它的检测在癌症的早期诊断以及治疗方面具有十分重要的意义。最近，研究表明某些癌症疾病中microRNAs的含量发生了明显变化，因此，microRNAs可以作为癌症的生物标志物。MicroRNAs是一类内生的、长度约为19-24个核苷酸的单链小分子RNA。目前，检测miRNAs的主要技术是印迹杂交技术、阵列杂交技术和PCR扩增技术等。然而，这些技术存在一些不足之处，比如：印迹杂交技术需要样品量大、灵敏度低，阵列杂交技术需要昂贵的仪器、检测成本较高，PCR扩增技术对实验条件要求苛刻、步骤繁琐。电化学传感器具有使用方便、测量精度高、维护简单和成本低等优点，基于电化学技术的优势和纳米材料信号放大的性质，科研工作者曾尝试采用电化学手段实现microRNAs的检测，但这些方法需要对纳米材料进行表面修饰，步骤繁琐、程序复杂、灵敏度较低，不利于实际样品的实时检测。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服目前microRNAs检测中存在的上述问题，提供一种用于microRNAs检测的电化学方法。为实现本专利技术的目的，采用了下述的技术方案：一种用于microRNAs检测的电化学方法，包括以下步骤：A：纳米银溶液的制备：采用前驱体为硝酸银，还原剂为硼氢化钠，稳定剂为柠檬酸钠，将硝酸银溶液加入到柠檬酸钠溶液中，剧烈搅拌1分钟后，加入硼氢化钠溶解，继续在室温条件下搅拌2小时，即得到柠檬酸稳定的纳米银溶液，低温储存2天后备用；B：工作电极的制备，包括以下子步骤：B1：在玻碳电极表面电沉积金纳米粒子；B2：在步骤B1所制得的电极表面组装巯基化的DNA捕获探针：5'-TGACTTCAACATCAGTCTGATAAGCTAAGTCAT-(CH2)6-SH-3'；B3：采用6-巯基己醇封闭步骤B2所制得的电极未反应的金表面；B4：将microRNAs修饰到步骤B3得到的电极表面；B5：将4-巯基苯硼酸和步骤A得到的纳米银溶液混合物修饰到步骤B4得到的电极表面，形成纳米银网络结构；C：电化学测试：将步骤B制备得到的电极作为工作电极进行电化学测试；进一步的，步骤A得到的纳米银溶液低温保存备用，保存温度为4~8℃；进一步的，步骤B1中的玻碳电极直径为3mm；进一步的，步骤B2中的DNA捕获探针的浓度为50µM，采用100mM氯化钠的Tris缓冲溶液配制，Tris的浓度为20mM，pH值为7.4；进一步的，步骤B3中的6-巯基己醇用乙醇溶解，6-巯基己醇浓度为1mM；进一步的，步骤B4中microRNAs采用100mM氯化钠的Tris缓冲溶液配制，Tris缓冲溶液的浓度为20mM，pH值为7.4，所述的Tris缓冲溶液采用焦碳酸二乙酯处理过的二次蒸馏水配制；进一步的，步骤B5中将步骤B4制得的电极浸泡在浓度为3.5µM的4-巯基苯硼酸溶液中，然后加入浓度为1nM的纳米银溶液，反应30分钟后用蒸馏水冲洗电极，除去未结合的纳米银粒子；所述的4-巯基苯硼酸溶液用PBS溶液配制，PBS的浓度为5mM，pH值为7.4；进一步的，步骤C中电化学测试采用三电极体系，步骤B制备的电极作为工作电极，饱和的Ag/AgCl电极为参比电极，Pt电极为辅助电极。本专利技术所提供的方法的有益技术效果为：RNA分子与DNA分子的主要区别之一在于：RNA分子糖基的2’号碳上含有一个羟基，因此，其3’末端核苷酸的糖基中含有两个相邻的顺式羟基，（即顺式邻二醇结构单元），而邻二醇可以与苯硼酸衍生物形成硼酸酯衍生物。此外，柠檬酸是制备金银纳米粒子时最常用的经典稳定剂，而柠檬酸也能够与苯硼酸衍生物形成硼酸酯键作用。基于这些作用特点，本专利技术采用4-巯基苯硼酸（MPBA）作为侨联剂，结合纳米银的电化学性质，开发了一种简单、快速、灵敏检测microRNAs的电化学传感器，microRNAs的3’末端的糖基中含有邻二醇结构单元，可以和4-巯基苯硼酸中的硼酸基团相互作用，形成硼酸酯键，从而实现了microRNAs的特异性衍生。4-巯基苯硼酸上的巯基可以与柠檬酸稳定的纳米银形成Ag-S键，从而将纳米银捕获到电极表面，电极表面的纳米银进一步通过Ag-S键作用和苯硼酸-柠檬酸之间的硼酸酯键作用吸附溶液中的4-巯基苯硼酸和纳米银，从而将更多的纳米银固定到电极表面，如此反复，即在电极表面原位形成了纳米银网络结构。本专利技术采用DNA捕获探针捕获microRNAs，有利于提高分析检测的特异性；采用4-巯基苯硼酸对microRNAs进行衍生，有利于通过Ag-S键作用和苯硼酸-柠檬酸之间的硼酸酯键作用将多个纳米银粒子固定于电极表面，灵敏性高。本专利技术无需对纳米银粒子进行修饰、通过原位生长的方式即可在电极表面形成纳米银网络结构，操作简单、成本较低、检测时间短、稳定性好。附图说明图1是4-巯基苯硼酸与柠檬酸反应形成的复合物的质谱图。图2是4-巯基苯硼酸与腺嘌呤核苷酸反应形成的复合物的质谱图。图3是4-巯基苯硼酸与胞嘧啶核苷酸反应形成的复合物的质谱图。图4为纳米银分别在有无4-巯基苯硼酸存在条件下的紫外-可见吸收光谱图。图5为4-巯基苯硼酸诱导纳米银聚集的透射电镜表征图。图6是电极在经过和不经过microRNA-21修饰步骤处理的线性扫描伏安图。图7是修饰不同浓度的microRNA-21时的线性扫描伏安图。图8是氧化电流与microRNA-21浓度的关系图。图9是电极在经过不同的microRNAs序列修饰步骤的线性扫描伏安图。具体实施方式为了更充分的解释本专利技术的实施，提供本专利技术的实施实例。这些实施实例仅仅是对该工艺的阐述，不限制本专利技术的范围，本专利技术中用以下实施例说明，但不限于下述实施例，任何变化实施都包含在本专利技术的技术范围内。本专利技术中各种缩写所代表的物质分别为：5'-TGACTTCAACATCAGTCTGATAAGCTAAGTCAT-(CH2)6-SH-3'：DNA捕获探针，5'-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3'：microRNA-21，Tris：三羟甲基氨基甲烷，PBS：磷酸盐缓冲液，MPBA：4-巯基苯硼酸，MCH：6-巯基己醇；mM、µM、pM、fM均为浓度单位，分别代表10-3mol/L、10-6mol/L、10-12mol/L、10-15mol/L。以下实施例以microRNA-21作为待测糖蛋白进行具体阐述。申请中涉及到的DNA、microRNAs-21、以及各碱基错配的microRNA-21均是由生工生物工程（上海）股份有限公司合成提供的。对附图进一步的解释，图4中曲线a为纳米银的紫外-可见吸收光谱图，曲线b为纳米银在4-巯基苯硼酸存在条件下的紫外-可见吸收光谱图。图6中为电极在经过（曲线a）和不经过（曲线b）microRNA-21修饰步骤的线性扫描伏安图，曲线a对应的microRNA-21的浓度为2pM，支持电解质为KCl。图7中从上到下对应的microRNA-21本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于microRNAs检测的电化学方法，包括以下步骤：A： 纳米银溶液的制备：采用前驱体为硝酸银，还原剂为硼氢化钠，稳定剂为柠檬酸钠，将硝酸银溶液加入到柠檬酸钠溶液中，剧烈搅拌1分钟后，加入硼氢化钠溶解，继续在室温条件下搅拌2小时，即得到柠檬酸稳定的纳米银溶液，低温储存2天后备用；B：工作电极的制备，包括以下子步骤：B1：在玻碳电极表面电沉积金纳米粒子；B2：在步骤B1所制得的电极表面组装巯基化的DNA捕获探针：5'‑TGACTTCAACATCAGTCTGATAAGCTAAGTCAT‑(CH2)6‑SH‑3'；B3：采用6‑巯基己醇封闭步骤B2所制得的电极未反应的金表面；B4：将microRNAs修饰到步骤B3得到的电极表面；B5：将4‑巯基苯硼酸和步骤A得到的纳米银溶液混合物修饰到步骤B4得到的电极表面，形成纳米银网络结构；C：电化学测试：将步骤B制备得到的电极作为工作电极进行电化学测试。

【技术特征摘要】
1.一种用于microRNAs检测的电化学方法，包括以下步骤：A：纳米银溶液的制备：采用前驱体为硝酸银，还原剂为硼氢化钠，稳定剂为柠檬酸钠，将硝酸银溶液加入到柠檬酸钠溶液中，剧烈搅拌1分钟后，加入硼氢化钠溶解，继续在室温条件下搅拌2小时，即得到柠檬酸稳定的纳米银溶液，低温储存2天后备用；B：工作电极的制备，包括以下子步骤：B1：在玻碳电极表面电沉积金纳米粒子；B2：在步骤B1所制得的电极表面组装巯基化的DNA捕获探针：5'-TGACTTCAACATCAGTCTGATAAGCTAAGTCAT-(CH2)6-SH-3'；B3：采用6-巯基己醇封闭步骤B2所制得的电极未反应的金表面；B4：将microRNAs修饰到步骤B3得到的电极表面；B5：将4-巯基苯硼酸和步骤A得到的纳米银溶液混合物修饰到步骤B4得到的电极表面，形成纳米银网络结构；C：电化学测试：将步骤B制备得到的电极作为工作电极进行电化学测试。2.根据权利要求1所述的一种用于microRNAs检测的电化学方法，其特征在于：步骤A得到的纳米银溶液低温保存备用，保存温度为4~8℃。3.根据权利要求1所述的一种用于microRNAs检测的电化学方法，其特征在于：步骤B1中的玻碳电极直径为3mm。4.根据权利要求1所述的一种用于micro...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘林，夏宁，刘雷雷，邢云，
申请(专利权)人：安阳师范学院，
类型：发明
国别省市：河南;41