一种茶白星病病叶的分子检测方法技术

本发明专利技术涉及一种茶白星病病叶的分子检测方法，其包括根据茶白星病菌DNA序列的特性，设计以内引物对：采集茶叶，以痂囊腔菌分离纯化培养；采用真菌基因组DNA试剂盒提取上述培养液中的茶白星病菌基因组DNA；以上述基因组DNA为模板进行特异性LAMP扩增反应；在上述反应体系中加入荧光染料，可判断采集的茶叶是否发生了茶白星病。本发明专利技术的分子鉴定是融合了光谱技术的精确定量、DNA杂交的特异性以及其敏感性，在对病菌进行检验过程中，与形态观察及病菌分离回接鉴定比较，可以实现在茶白星病的早期未显症时期的快速鉴定，2天时间即可准确完成批量的样品鉴定，有利于病害的及时准确防治，从而实现茶园有效的提质增效。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于农作物病害检测及防治
，具体涉及一种茶白星病病叶的分子检测方法。
技术介绍
茶白星病(Teawhitescab)是全球高海拔茶园最严重的真菌病害之一，病症与茶圆赤星病及虫害为害初期症状易混淆，因此，以形态特征为基础的常规病害诊断技术难以及时准确检测到茶白星病的发生，从而导致该病难以得到及时高效的防控，生产上通常采用多菌灵等化学农药对该病进行防控，因发病期常为多雨季节，不但防效不佳，杀菌剂的过量使用，导致茶叶农残超标事件屡屡发生，其首要关键环节在于茶白星病监控的技术创新性与实用性不够，2000年，Notomi等建立了一种非常实用而又有效的核酸扩增技术—环介导等温扩增。LAMP是对靶基因的6个特异部位设定4种引物，利用具有链置换活性的BstDNA聚合酶在恒温条件下催化新链合成，从而使靶基因高效扩增。传统的症状观察，茶白星病发病初期，只是小小红点凸起，与茶叶上发生茶圆赤星病及害虫叮咬症状极为相似，而等到出现典型鸟眼状症状时，已经是发病晚期，产量及品质都受到严重影响。如采用PCR分子检测技术灵敏度较好，但是操作繁琐、检测时间长、检测仪器及试剂昂贵，难以在基层推广。而目前LAMP检测技术主要应用于人畜病原物、食品安全和环境卫生的检测，在植物病原鉴定上应用较少。
技术实现思路
针对上述技术问题，本专利技术提供一种快速、准确检测茶白星病菌的分子方法，该方法利用LAMP技术扩增靶基因，设计引物，优化反应条件，建立一个从核酸抽提到LAMP检测痂囊腔菌的快速检测方法。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种茶白星病病叶的分子检测方法，其包括以下步骤：（1）根据茶白星病菌DNA序列的特性，设计以内引物对：SEQNO.1：F3（5’-GGGGACCGAACCAACTCT-3’)；SEQNO.2：B3（5’-TGCCCCTCGGAATACCAAG-3’)；外引物对：SEQNO.3：FIP（5’-GCCAGAACCAAGAGATCCGTTGT-TCTTGTGAAACCTTTGCAGTC-3’)；SEQNO.4：BIP（5’-TGAAGAACGCAGCGAAATGCG-GCGCAATGTGCGTTCAA-3’)；（2）采集茶叶，以痂囊腔菌分离纯化培养；（3）采用真菌基因组DNA试剂盒提取上述培养液中的茶白星病菌基因组DNA；（4）以上述基因组DNA为模板进行特异性LAMP扩增反应；（5）在上述反应体系中加入荧光染料，可判断采集的茶叶是否发生了茶白星病。作为优选，所述LAMP扩增反应体系如下：反应缓冲液12.5ul，其中FIP：30pmol，BIP：30pmol，F3：10pmol，B3：10pmol，BstDNA聚合酶1ul，加去离子水配成23ul。作为优选，所述反应缓冲液组成：Tris－HCl（pH8.8）：40mM，KCl：20mM，MgSO4:16mM，（NH4）2SO4：20mM，Tween20：0.2％，Betaine：1.6M，dNTPs：2.8mM每种。作为优选，阳性对照DNA：用限制性内切酶HindⅢ消化λ噬菌体DNA后，取其片段（6557bp）重组入质粒所得；阴性对照：反应体系未添加DNA。作为优选，LAMP扩增条件为外引物：内引物=3:1，63℃lh反应后立即于80℃10min使酶灭活。作为优选，所述荧光染料为1％SYBRgreenI。作为优选，反应体系中加入荧光染料后，于自然光及紫外灯下观察，可观察到绿色荧光，则茶叶发生了茶白星病。作为优选，反应体系中加入荧光染料后，用琼脂糖凝胶电泳检测，出现LAMP特征性的梯形带，则茶叶发生了茶白星病。作为优选，所述电泳条件为：LAMP产物在1.0％琼脂糖凝胶上用0.5×TBE缓冲液中电泳分析，电压为4-5V/cm。从以上技术方案可知，本专利技术的分子鉴定是融合了光谱技术的精确定量、DNA杂交的特异性以及其敏感性，在对病菌进行检验过程中，与形态观察及病菌分离回接鉴定比较，可以实现在茶白星病的早期未显症时期的快速鉴定，2天时间即可准确完成批量的样品鉴定，有利于病害的及时准确防治，从而实现茶园有效的提质增效；且LAMP技术可在恒定温度(一般60℃～65℃)下进行目的片段的大量扩增，操作简单、成本低，同时具有很高的特异性和灵敏度，且检测结果能实现可视化，更适合于条件落后的部门开展工作。附图说明图1为特异性实验的显色法检测结果。其中：1、4：阳性对照；2：痂囊腔菌；5：茶炭疽病菌；3、6：阴性对照；1、2、4号管反应液颜色为绿色，3、5、6号管反应液颜色为橙色。图2为灵敏度实验的显色法检测结果。其中：1：10-2；2：10-3；3：10-4；4：10-5，1-4号管反应液颜色为绿色。图3为LAMP对照的电泳法检测结果。其中：M：Marker2000。具体实施方式下面结合附图将详细说明本专利技术，在此本专利技术的示意性实施例以及说明用来解释本专利技术，但并不作为对本专利技术的限定。一种茶白星病病叶的分子检测方法，其包括以下步骤：1.茶白星病菌检测的特殊引物设计：根据茶白星病菌DNA序列的特性，合成对茶白星病菌具特异扩增作用的一套引物：SEQNO.1：F3（5’-GGGGACCGAACCAACTCT-3’)；SEQNO.2：B3（5’-TGCCCCTCGGAATACCAAG-3’)；SEQNO.3：FIP（5’-GCCAGAACCAAGAGATCCGTTGT-TCTTGTGAAACCTTTGCAGTC-3’)；SEQNO.4：BIP（5’-TGAAGAACGCAGCGAAATGCG-GCGCAATGTGCGTTCAA-3’)。2.茶白星病菌检测体系的建立：（1）采集茶叶，以痂囊腔菌分离纯化培养；采用TIANGEN公司真菌基因组DNA试剂盒提取上述培养液中的茶白星病菌基因组DNA；（2）以上述基因组DNA为模板进行特异性LAMP扩增反应；（3）LAMP反应体系配置：反应缓冲液12.5ul，其中FIP：30pmol，BIP：30pmol，F3：10pmol，B3：10pmol，BstDNA聚合酶1ul，加去离子水（DW）配成23ul。其中反应缓冲液组成：Tris－HCl（pH8.8）：40mM，KCl：20mM，MgSO4:16mM，（NH4）2SO4：20mM，Tween20：0.2％，Betaine：1.6M，dNTPs：2.8mM每种。阳性对照DNA：用限制性内切酶HindⅢ消化λ噬菌体DNA后，取其片段（6557bp）重组入质粒所得。阴性对照：反应体系未添加DNA。反应体系和反应条件：外引物：内引物=3:1，63℃lh反应后立即于80℃10min使酶灭活。（4）LAMP产物荧光目视检测时，向预混溶液中添加Loopamp®“朗报®”荧光目视检测试剂。该方法可特异的检出E.leucospil。电泳在1.0％琼脂糖凝胶上用0.5×TBE缓冲液中电泳分析，电压为4-5V/cm，电泳结束后用凝胶成像系统分析。本专利技术所用引物对茶白星病菌具有很高的特异性，能够用于区别茶白星病与其余病害的检测。实施例11.茶白星病菌检测的特殊引物设计：根据茶白星病菌DNA序列的特性，合成了对茶白星病菌具特异扩增作用的一套引物：SEQNO.1：F3（5’-GGGGACCGAACCAACTCT-3’)；本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种茶白星病病叶的分子检测方法，其包括以下步骤：（1）根据茶白星病菌DNA序列的特性，设计以内引物对：SEQNO.1：F3（5’‑GGGGACCGAACCAACTCT‑3’)；SEQNO.2：B3（5’‑TGCCCCTCGGAATACCAAG‑3’)；外引物对：SEQNO.3：FIP（5’‑GCCAGAACCAAGAGATCCGTTGT‑TCTTGTGAAACCTTTGCAGTC‑3’)；SEQNO.4：BIP（5’‑TGAAGAACGCAGCGAAATGCG‑GCGCAATGTGCGTTCAA‑3’)；（2）采集茶叶，以痂囊腔菌分离纯化培养；（3）采用真菌基因组DNA试剂盒提取上述培养液中的茶白星病菌基因组DNA；（4）以上述基因组DNA为模板进行特异性LAMP扩增反应；（5）在上述反应体系中加入荧光染料，可判断采集的茶叶是否发生了茶白星病。

【技术特征摘要】
1.一种茶白星病病叶的分子检测方法，其包括以下步骤：（1）根据茶白星病菌DNA序列的特性，设计以内引物对：SEQNO.1：F3（5’-GGGGACCGAACCAACTCT-3’)；SEQNO.2：B3（5’-TGCCCCTCGGAATACCAAG-3’)；外引物对：SEQNO.3：FIP（5’-GCCAGAACCAAGAGATCCGTTGT-TCTTGTGAAACCTTTGCAGTC-3’)；SEQNO.4：BIP（5’-TGAAGAACGCAGCGAAATGCG-GCGCAATGTGCGTTCAA-3’)；（2）采集茶叶，以痂囊腔菌分离纯化培养；（3）采用真菌基因组DNA试剂盒提取上述培养液中的茶白星病菌基因组DNA；（4）以上述基因组DNA为模板进行特异性LAMP扩增反应；（5）在上述反应体系中加入荧光染料，可判断采集的茶叶是否发生了茶白星病。2.根据权利要求1所述茶白星病病叶的分子检测方法，其特征在于：所述LAMP扩增反应体系如下：反应缓冲液12.5ul，其中FIP：30pmol，BIP：30pmol，F3：10pmol，B3：10pmol，BstDNA聚合酶1ul，加去离子水配成23ul。3.根据权利要求2所述茶白星病病叶的分子检测方法，其特征在于：所述反应缓冲液组成：Tris－HC...

【专利技术属性】
技术研发人员：周凌云，刘红艳，李维，向芬，丁玎，曾振，
申请(专利权)人：湖南省茶叶研究所湖南省茶叶检测中心，
类型：发明
国别省市：湖南;43