高获得率提取替曲朵辛的方法技术

从河豚鱼卵巢中提取替曲朵辛的方法包括以下５个步骤：第一步：用水和加入卵巢重量０．１％－１％的乙酸浸泡河豚鱼卵巢数小时，然后加压快速过滤。第二步：加热浸取液７０－９５℃除去可溶蛋白。第三步：用有机碱的水溶液（例如氨水）调节过滤出蛋白的清液ｐＨ值在６．０－７．５之间，过阳离子交换树脂富集“替曲朵辛”。第四步：调节含替曲朵辛溶液的ｐＨ值并在一定时间内通过活性炭与硅藻土柱，去除碱性氨基酸。第五步：真空浓缩纯化”替曲朵辛”结晶。按照该提取方法，可将替曲朵辛的提取率提高到现有技术的３倍，即以１００公斤河豚鱼有毒卵巢计算，可以提取出纯度为８０－８８％的“替曲朵辛”４－６克。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种能以高获得率从河豚鱼内部组织(例如卵巢)中提取替曲朵辛的方法。替曲朵辛属于小分子非蛋白的高活性神经毒素，主要存在于河豚鱼的卵巢、肝脏和血液中，其它部分含量极微。TTX也在其它动物甚至海藻中发现，包括蜥蜴，加州蝾螈，虎虾鱼，蓝环章鱼等。替曲朵辛化学名是八氢-12-(羟甲基)-2-亚氨基-5，97，10 α-二甲桥-10αH-二桥氧并嘧啶-4，7，10，11，12-戊醇分子式C11H17N308分子量319.27其结构式为 TTX的结构特征是仅有一个碳环，一个胍基，六个羟基和-个半醛糖内酯基团。纯的″替曲朵辛″是无色的结晶粉末。加热到220℃结晶变暗没有分解。″替曲朵辛″溶于酸性水溶液，不溶于水及有机溶剂在水溶液中的Pka为8.76，属于碱性动物生物碱。在中性或有机酸性溶剂中对热相当稳定，在强酸和强碱性水溶液中迅速破坏。用高压液相法分离、测定的天然河豚鱼中的毒素是含有10余种类似物的混合物，其中主要成分叫″替曲朵辛″它的含量在70％-80％之间。另外三种主要类似物为河豚酸、4一表替曲朵辛和脱水4一表替曲朵辛。这三个″替曲朵辛″的化学性质，有些微小的差别，但生物活性差别较大，例如它们的毒性，TTX的毒性为4500鼠单位/毫克，4-表替曲朵辛″的毒性仅为710鼠单位/毫克，而脱水4去4替曲朵辛″的毒性降低到92鼠单位/毫克(Toxicon，23 271-7276(1985))。获取TTX的方法有2种，即人工合成和生物提取。1975年日本山口大学农业化学系的岸义人等人成功地合成了外消旋TTX。对TTX的生物提取始于本世纪初的1909年，日本人田原(J.pharm-soc.Japan 22 587(1909)，Biochem-z.30255，1911)用醋酸铅与氨水处理河豚鱼卵巢，得到了毒力为4.1γ(对1克小鼠平均极限致死量表示为MLD4.1γ/g，简写为4.1γ)的粗品，并将其命名为现在使用的″Tetrodotoxin″。在以后儿十年中，又出现了多种提取方法，有代表性的如横尾在1950年(日本化学杂志71 590，1950)用水浸取其卵巢，蒸干，得到于物质后，用醋酸铅与氨水使毒素共同沉淀，用磷钨酸，苦味酸汞除去不纯物，用苯肼除糖，再用苦味酸汞处理，最后依次用苦酮酸、甲醇、苦酮酸再处理，从20公斤卵巢中仅获得MLD0.8的结晶毒素13mg。永井1951年(福冈医志经1(1954))第一次使用离子交换树脂AmberliteIRe-50吸附毒素，用盐酸洗脱，再用Amberlite IR-4B除去盐酸，浓缩后用无水乙醇提取毒素，最后从20公斤卵巢中得到MLD 0.008r的毒素结晶2.5mg。1952年，津田与河村搞了一个用活性炭层析的大规模生产法(津田，化学的η领域，增刊，80 9(1967))，可以处理1000公斤卵巢并获得MLD 10μg/kg的毒素10克。在此同时，美国哈佛大学的Woodward(R.B.Woodward，Pure Appl.chem..9249-74(1964))也获得类似的结果。1964年後藤俊夫等(後藤俊夫、高桥等，日本化学杂志85 508，1964)使用离子交换和活性炭吸附的提纯方法，从100公斤卵巢可以获得他们称的粗毒素1-2克，使得率有了明显的提高。其工艺流程见附图说明图1.。1980年代后，陆续有学者报导了一些新的提取方法，迄今为止发表的提取方法不少于十几种，但得率并没有大的提高，仅为100公斤卵巢中提取TTX 1-2g。而本专利申请的提取方法，可以从100公斤卵巢中提取TTX 4-6g，得率高出已有方法的3倍。其工艺流程见图2.。″替曲朵辛″(简称TTX)结晶品提取采用如图1所示工艺流程操作。1.水浸取过程取河豚鱼有毒性的卵巢数十公斤，绞碎为小于1厘米的碎块，放置于浸取一过滤装置中，加入1∶1.5的去离子水，为了使TTX更好地从卵巢中浸取出，加入卵巢重量0.1-1％的乙酸。开动搅拌，在室温搅拌数小时，停止搅拌，然后开动真空泵减压过滤，数分钟后，开动压缩机，让浸取一过滤装置上部压力达到0.5-1公斤/平方厘米。收集滤液，快速加热至70-95℃，加热时间3-25分钟，冷却后过滤出析出的蛋白，得黄色透明液体，称为第一次浸取清液。用0.4毫升第一次浸取清液注射于20克重量小白鼠的腹腔，如果小白鼠在50秒内死亡，则该卵巢定为猛毒性原料如果小白鼠在50-70秒内死亡，则该卵巢被认为强毒性原料如果小白鼠在70-90秒内死亡，则卵巢被认为弱毒性原料超过90秒死亡的卵巢浸取液，没有使用价值。最好使用条纹东方豚的强毒性卵巢。向第一次浸取过滤后的滤渣加入去离子水，搅拌数小时，如第一次浸取一样，过滤，加热，过滤，收集第二次浸取液。用类似的方法，收集第三次、第四次浸取清液。如果使用猛毒性和强毒性卵巢，仍需收集第四次浸取清液，如果使用弱毒性卵巢，只需收集第三次浸取清液。将第一、第二、第三和第四次浸取液合并在一起，叫做浸取清液，用生物法或HPLC法测定浸取清液毒素含量。2.离子交换富集和分离毒素过程将浸取清液用氨水调节溶液pH值达6.0-7.5，如果有沉淀产生，过滤出沉淀，将过滤所得浸取清液通过阳离子交换树脂柱，流出速度为2000-3750毫升/小时，流出液用硅胶薄版监控有没有毒素泄露。如果发现有TTX泄漏立即换新的树脂柱。浸出清液全部通过柱子后，用去离子水洗柱子直到洗到交换柱不再保留蛋白为止。再用5-12％的乙酸溶液洗交换柱，洗脱流出速度500-2500毫升/小时，按每份1500毫升收集洗脱液，每份用TLC检测、收集含有毒素的洗脱液。3.活性炭纯化过程合并从离子交换柱上用乙酸洗脱出含有毒素的溶液，用浓氨水调节溶液pH值为8-9，该条件下的时间应控制在2-4小时。然后通过由活性炭和另一组份硅藻土填充的柱子，去离子水洗柱子后，用含有酸的醇溶液(酸和醇浓度在0.5-40％之间)洗柱，尽可能洗下所吸附的毒素(用TLC检测)。4.浓缩结晶过程将全部从柱上洗脱下来的含有毒素的溶液在减压下浓缩，冷却后，用氨水调节溶液pH值为8-9，放置后让TTX沉淀.然后过滤出沉淀，用去离子水洗沉淀数次，然后抽干将沉淀溶于乙酸，再加氨水让TTX沉淀再沉淀，如此操作再重复一次，将获得的TTX结晶放在真空干燥器中干燥24小时，干燥至恒重后，得到TTX结晶。用HPLC方法测定其含量。然后，将上述滤液合并，滤液被加热到80℃5分钟，冷却后，过滤出凝固的蛋白。用氨水调节过滤出蛋白后的清液pH值达7.5。将pH值达7.5的清液通过直径6cm，填充D-152树脂(中国天津南开大学化工厂生产)铵型的1米高弱酸性阳离子交换树脂柱，所有清液通过树脂柱后，用去离子水洗柱子，柱子被洗清后用10％乙醋水溶液淋洗出TTX。收集含TTX洗脱液，用浓氨水中和至pH8.5。将pH8.5含TTX溶液通过活性炭.硅藻土柱，让TTX吸附在活性炭.硅藻土柱上，然后用含0.1％乙酸的20％乙醇水溶液洗出TTX，洗出的含TTX溶液在旋转蒸发器中浓缩到10-20毫升，冷却后用浓氨水调节浓缩液至pH等于9，放置冰箱中冷却析出TTX结晶，将结晶过滤出，溶于5％乙酸，再用浓氨水调节溶液pH等于9，再一次沉淀出TTX.过滤出TTX，获得TTX结晶后放在本文档来自技高网...

【技术保护点】
从河豚鱼卵巢中提取替曲朵辛的方法具有以下特征： （ａ）用含乙酸的水浸泡河豚鱼内部组织，然后加压快速过滤得到浸取液。 （ｂ）在沸点以下的温度加热浸取液除去可溶性蛋白。 （ｃ）用有机碱溶液调节清液的ｐＨ值，过弱酸性阳离子交换树脂富集替曲朵辛。 （ｄ）调节含替曲朵辛溶液的ｐＨ值，并在一定时间内通过活性炭与硅藻土柱。去除碱性氨基酸。 （ｅ）真空浓缩替曲朵辛溶液。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：周茂青，沈希光，
申请(专利权)人：威克斯医药有限公司，
类型：发明
国别省市：HK[中国|香港]