鉴定不同免疫磁珠细胞分离器分选细胞效率的方法技术

本发明专利技术公开了一种鉴定不同免疫磁珠细胞分离器分选细胞效率的方法，以标有磁珠的淋巴细胞CD3抗体为指标，用流式细胞仪检测分析CD3+阳性细胞百分含量,并用归一法算出相对百分比,比较不同强度的磁体分离器分选多人血液淋巴细胞的分离效果，以达到选取最佳磁场的分离器来分选各种细胞的目的。由于全血淋巴细胞来源广泛；流式细胞仪检测CD3+细胞方法简便；免疫磁珠分选CD3+易于操作，可方便快捷的鉴定出不同磁场强度的免疫磁珠分离器分离细胞的能力。可以为分选细胞的磁珠分离器提供一种快速、方便、有效的选择方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及免疫磁珠分离器的鉴定，尤其是一种利用流式细胞仪检测CD3+细胞来鉴定不同免疫磁珠分离器分选细胞效率的方法。
技术介绍
免疫磁珠分离技术是将免疫学反应的高度特异性与磁珠特有的磁响应性相结合的一种新的免疫学技术,它基于抗原通过功能基团与连接在磁珠上的特异性单抗相结合，形成抗原-抗体-磁珠免疫复合物,这种复合物具有较高的磁响应性,在外磁铁磁力的作用下定向移动，使复合物与其他物质分离，而达到分离、浓缩、纯化微生物或特异性抗原物质的目的。该项技术在细胞分离、蛋白、免疫学及微生物学检测等方面具有广泛的应用前景。免疫磁珠细胞分离的纯度和收获率关键取决于免疫磁珠和磁场强度。磁珠是含有四氧化三铁超顺磁性微球，其表面标记活性基团如氨基、羧基、巯基等，通过共价或者非共价偶联反应与抗体结合，形成免疫磁性微球。优质微载体的性能为：合适、均一的磁响应强度；较小、均一的粒径；稳定均一、特异吸附的表面性能。而外磁场的磁场强度应该与磁珠匹配，以达到最佳的分离效果。太小的磁珠、太小的磁场、稳定性不够的偶联等使得目的细胞得率不高，太大的磁珠和磁场又会影响细胞活性等。目前市场上的免疫磁珠分离器有两种类型：需要柱子分离的分离器和高强度磁场的磁体分离器。各自有不同的优缺点，前者以德国美天旎公司为主，而后者因操作简单便捷方便而成为主流。美天旎公司磁体的磁场强度一般在200mt左右，依靠外挂的分离柱将磁场强度放大，使直径为50nm微珠附着在磁柱中，通过洗脱从而达到分离的效果；细胞无需解离磁珠即可进行后续的实验，但分选出来的细胞状态欠佳。外磁体分选产品的主要公司为Dial\\Stemcell\\BD等著名公司和一些国产公司，磁珠一般在200nm-1.5um，磁场为400mt以上，分离的细胞纯度高；且流式细胞仪检测兼容。市场上也有很多公司提供自制的磁体来分离细胞，其中已申请专利的有板状的、磁笔、微量的、组合式的磁性分离装置等。鉴于免疫磁珠分选技术普遍化,如何快速有效的鉴定商业上现有的分离器最佳的磁场强度和制造所需要的磁场是摆在研究者面前的一个大问题。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，提供一种鉴定不同免疫磁珠细胞分离器分选细胞效率的方法，可以判断包括所有类型的免疫磁珠分离器的分选细胞的效果。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：一种鉴定不同免疫磁珠细胞分离器分选细胞效率的方法，以标有磁珠的淋巴细胞CD3抗体为指标，用流式细胞仪检测分析CD3+阳性细胞百分含量,并用归一法算出相对百分比,比较不同强度的磁体分离器分选多人血液淋巴细胞的分离效果，以达到选取所需磁场的分离器来分选各种细胞。具体地说，包括以下步骤：(1)取肝素抗凝全血加至聚苯乙烯管中，先加入CD3细胞正选试剂盒自带的红细胞裂解液,再依次加入CD3细胞正选试剂盒中的分选缓冲液和提前预混过的磁性粒子，室温孵育；(2)加入磁珠分选介质定容，放入待测的细胞分离器的磁体中进行分选,弃去上清液，重复步骤(2)；(3)用PBS缓冲液重悬细胞，即得到人淋巴细胞中CD3+细胞；(4)阴性对照、未分选细胞及分选后细胞分别加入抗人CD3抗体，混合均匀，避光孵育，离心弃上清，细胞用体积比浓度为1％多聚甲醛固定，4℃避光，使用流式细胞分析仪检测CD3细胞比例；(5)采用BDFACSDiVa软件分析T淋巴细胞CD3+阳性细胞百分含量,并采用归一计算方法，算出不同人血液中CD3+阳性细胞的相对百分含量,以比较各种磁体分选不同人血液淋巴细胞的能力，从而选择出所需磁场的分离器用于分选细胞。所述步骤(2)中放入待测的细胞分离器的磁体中进行分选，分选采用手动方式，将磁体和试管一起上下倾倒10s，回到直立位置静置5min。所述步骤(2)中放入待测的细胞分离器的磁体中进行分选，分选采用机械旋转方式，将磁体和试管一起旋转1000r2min静置3min。所述步骤(2)中磁珠分选介质为含1mmol/LEDTA，2％FBS的0.01mol/LPBS缓冲液，百分数为体积比。所述CD3细胞正选试剂盒为stemcell公司的CD3细胞正选试剂盒。所述步骤(2)中重复步骤(2)为3次。所述流式细胞分析仪为BD_FACSCanto_II型流式细胞分析仪，激光波长为488nm，发射波长为525nm。本专利技术的有益效果是：全血淋巴细胞来源广泛；流式细胞仪检测CD3+细胞方法简便；免疫磁珠分选CD3+易于操作，可方便快捷的鉴定出不同磁场强度的免疫磁珠分离器分离细胞的能力。可以为分选细胞的磁珠分离器提供一种快速、方便、有效的选择方法。附图说明图1正选人抗凝全血CD3淋巴细胞，Stemcell磁体(900mt)、国产磁体(900mt\\500mt)手动上下倾倒及旋转方式分选流式结果。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细说明：本专利技术一种鉴定不同免疫磁珠细胞分离器分选细胞效率的方法，以标有磁珠的淋巴细胞CD3抗体为指标，用流式细胞仪检测分析CD3+阳性细胞百分含量,并用归一法算出相对百分比,比较不同强度的磁体分离器分选多人血液淋巴细胞的分离效果，以达到选取所需磁场的分离器来分选各种细胞。具体地说，包括以下步骤：(1)取肝素抗凝全血加至聚苯乙烯管中，先加入CD3细胞正选试剂盒自带的红细胞裂解液,再依次加入CD3细胞正选试剂盒中的分选缓冲液和提前预混过的磁性粒子，室温孵育；(2)加入磁珠分选介质定容，放入待测的细胞分离器的磁体中进行分选,弃去上清液，重复步骤(2)；(3)用PBS缓冲液重悬细胞，即得到人淋巴细胞中CD3+细胞；(4)阴性对照、未分选细胞及分选后细胞分别加入抗人CD3抗体，混合均匀，避光孵育，离心弃上清，细胞用体积比浓度为1％多聚甲醛固定，4℃避光，使用流式细胞分析仪检测CD3细胞比例；(5)采用BDFACSDiVa软件分析T淋巴细胞CD3+阳性细胞百分含量,并采用归一计算方法，算出不同人血液中CD3+阳性细胞的相对百分含量,以比较各种磁体分选不同人血液淋巴细胞的能力，从而选择出所需磁场的分离器用于分选细胞。所述步骤(2)中放入待测的细胞分离器的磁体中进行分选，分选采用手动方式，将磁体和试管一起上下倾倒10s，回到直立位置静置5min。所述步骤(2)中放入待测的细胞分离器的磁体中进行分选，分选采用机械旋转方式，将磁体和试管一起旋转1000r2min静置本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴定不同免疫磁珠细胞分离器分选细胞效率的方法，其特征在于，以标有磁珠的淋巴细胞CD3抗体为指标，用流式细胞仪检测分析CD3+阳性细胞百分含量,并用归一法算出相对百分比,比较不同强度的磁体分离器分选多人血液淋巴细胞的分离效果，以达到选取所需磁场的分离器来分选各种细胞。

【技术特征摘要】
1.一种鉴定不同免疫磁珠细胞分离器分选细胞效率的方法，其特征在于，
以标有磁珠的淋巴细胞CD3抗体为指标，用流式细胞仪检测分析CD3+阳性细
胞百分含量,并用归一法算出相对百分比,比较不同强度的磁体分离器分选
多人血液淋巴细胞的分离效果，以达到选取所需磁场的分离器来分选各种细
胞。
2.根据权利要求1所述的鉴定不同免疫磁珠细胞分离器分选细胞效率的
方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取肝素抗凝全血加至聚苯乙烯管中，先加入CD3细胞正选试剂盒自
带的红细胞裂解液,再依次加入CD3细胞正选试剂盒中的分选缓冲液和提前预
混过的磁性粒子，室温孵育；
(2)加入磁珠分选介质定容，放入待测的细胞分离器的磁体中进行分选,
弃去上清液，重复步骤(2)；
(3)用PBS缓冲液重悬细胞，即得到人淋巴细胞中CD3+细胞；
(4)阴性对照、未分选细胞及分选后细胞分别加入抗人CD3抗体，混合
均匀，避光孵育，离心弃上清，细胞用体积比浓度为1％多聚甲醛固定，4℃避
光，使用流式细胞分析仪检测CD3细胞比例；
(5)采用BDFACSDiVa软件分析T淋巴细胞CD3+阳性细胞百分含量,并
采用归一计算方法，算出不同人血液中CD3+阳性细胞的相对百分含量,以比
较各种磁体分选不同人血液淋巴细胞的能力，从而选择出所需磁场的分离器用
于分选细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：李洲，范维佳，刘晓华，黄慧玲，么秀华，孙雪莲，朱建民，李召雨，魏华英，刘江，周洪锐，李昀地，杨延瑞，
申请(专利权)人：关节动力安达天津生物科技有限公司，天津中新科炬生物制药有限公司，天津市神经外科研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12