一种基于多巴胺接枝两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白的凝胶基质及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种基于多巴胺接枝两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白的凝胶基质及其制备方法，属于生物材料技术领域；本发明专利技术的新型凝胶基质包含改性两性离子聚合磷酸胆碱、改性I型胶原蛋白。首先通过酰胺化反应合成多巴胺接枝改性两性离子聚合磷酸胆碱，然后通过多巴胺氧化聚合时的粘附性，将两性离子聚合磷酸胆碱连接到I性胶原蛋白基质表面，从而获得一种基于多巴胺接枝两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白的新型凝胶基质。该方法制备的新型凝胶基质具有优异的润滑性能，抗炎症因子性能以及良好的生物相容性，并可以很好地结合到受损软骨表面，克服了单一I型胶原蛋白力学性能不足、抗炎症因子性能差的缺点，而且该制备方法简便，原料易于合成，有很好的可行性和实用性，可在关节软骨修复中得到广泛的应用。

【技术实现步骤摘要】
一种基于多巴胺接枝两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白的凝胶基质及其制备方法
本专利技术涉及生物材料
，具体涉及一种基于多巴胺接枝两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白的新型凝胶基质及其制备方法。本专利技术的新型凝胶基质特别适用于软骨细胞培养，并同时具有抗非特异性吸附性能和润滑性能。
技术介绍
关节炎是最常见的慢性疾病之一，据统计，全世界共有3.55亿关节炎患者，其中1.9亿患骨关节炎，超过1650万人患类风湿关节炎。其中，急慢性软骨组织损伤造成的关节炎是全世界公认的致残性疾病，约占关节炎疾病患者的30%左右，该疾病的治疗在国际上都是个公认的难题。传统的外科治疗方法主要有关节镜下冲洗、微骨折术、关节磨削术等，但存在不能彻底治愈，需要多次微创手术，从根本上并不能为受损软骨周围的软骨细胞提供一个很好的栖息地。临床上，I型胶原蛋白植入基质(COLI)常用于关节软骨的修复再生，重建的软骨接近正常透明软骨组织，疗效持久，并且适用于损伤面积较大的关节软骨缺损。但是单一I型胶原蛋白基质力学性能不足，抗炎症因子性能较差，严重影响其植入后修复软骨的效果。二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)是哺乳动物关节滑液中存在的一种含量较高的脂质，研究表明脂质头基具有较好的抗污染能力和极低的摩擦系数，对预防关节磨损或干扰起关键作用。为了开发简便、实用同时具有抗非特异性吸附和润滑双重性能的软骨修复材料，受DPPC结构启发，利用磷酸胆碱头基聚合，得到两性离子毛刷状结构，以进一步提高其润滑性能、抗粘附特性。为改善I型胶原蛋白植入基质抗非特异性性能差、润滑性能不足的缺点，达到更好治疗软骨损伤的目的，受天然软骨表面结构启发，本专利技术设计合成了多巴胺接枝改性两性离子聚合磷酸胆碱（DOPA-B），通过多巴胺氧化聚合时的粘附性，将两性离子聚合磷酸胆碱牢牢连接到I型胶原蛋白基质表面，从而获得一种基于多巴胺接枝两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白的新型凝胶基质，通过此方法制备得到的凝胶基质既保留了I型胶原蛋白植入基质在软骨细胞迁移、生长和在受损软骨组织粘附的能力，同时又赋予了其优异的抗非特异性吸附性能和润滑性能。
技术实现思路
为克服上述现有技术的缺点和不足，本专利技术的首要目的在于提供一种基于多巴胺接枝两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白的新型凝胶基质。本专利技术另一目的在于提供上述基于两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白新型凝胶基质的制备方法。本专利技术再一目的在于提供上述基于两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白的新型凝胶基质在生物医药领域中的应用；特别适用于软骨细胞培养，并同时具有抗非特异性吸附性能和润滑性能。为实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案加以实现的：一种两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白的新型凝胶基质；是采用多巴胺接枝两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白凝胶基质，其中，多巴胺接枝两性离子聚合磷酸胆碱（DOPA-B）具有如下所述结构：本专利技术的两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白新型凝胶基质的制备方法，包括：1)酰胺化反应合成多巴胺接枝改性两性离子聚合磷酸胆碱（DOPA-B）：a)将两性离子聚合磷酸胆碱（B）加入到pH=7.4的磷酸盐缓冲液中，常温下搅拌溶解；b)按两性离子聚合磷酸胆碱与1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为2:1，往步骤a）所获溶液中加入1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐，反应20-30min，c）按盐酸多巴胺与两性离子聚合磷酸胆碱重复单元摩尔比为1-3:1，加入盐酸多巴胺（DOPA），反应1-3h；d)在去离子水中透析以除去催化剂及未反应单体，冷冻干燥得到白色棉花状产物——DOPA-B。上述步骤b）和c）中所述反应的温度在20-30℃；反应的体系pH为5-6，优选为5.5。2）I型胶原蛋白凝胶基质的制备：将含有凝胶液的胶原蛋白溶液倒入细胞培养板中，与培养箱中凝胶化，制备成I型胶原蛋白凝胶基质。3）两性离子聚合磷酸胆碱连接到I型胶原蛋白基质表面:a）将多巴胺接枝的两性离子聚合磷酸胆碱溶解在pH=8.5的磷酸盐缓冲液中，制得浓度为5-20mg/mL的溶液；b）将步骤2）制得的I型胶原蛋白基质浸入上述步骤a）溶液中，在25-50℃条件下反应4-12h，制得两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白的新型凝胶基质。所述I型胶原蛋白提取后，经过盐析、透析等步骤，以去除杂蛋白及其它已变性的蛋白，获得无毒、无热源、高纯度和高活性的I型胶原。本专利技术相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：1)本专利技术的两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白凝胶基质具有很好的抗非特异性吸附性能。在溶菌酶（带正电荷）、牛血清蛋白（带负电荷）中非特性吸附量分别为3.1ng/cm2、8.8ng/cm2，远低于在I型胶原蛋白基质表面的非特异性吸附量（详见见表1和图2），克服了单一I型胶原蛋白植入基质抗非特异性吸附性能差的缺点；2)本专利技术的两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白凝胶基质具有优异的润滑性能。在磷酸盐缓冲液（PBS，模拟生理环境）中的摩擦系数达0.02左右，见表1，克服了单一I型胶原蛋白润滑性能不足的缺点。本专利技术的两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白凝胶基质具有良好的软骨细胞迁移和生长性能，迁移的细胞分布均匀，且迁移的细胞并没有显示出任何形态学上的差别。附图说明图1多巴胺接枝两性离子聚合磷酸胆碱（DOPA-B）改性I型胶原蛋白凝胶基质的结构示意图。图2I型胶原蛋白凝胶基质与两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白凝胶基质对1mg/mL的溶菌酶（LYS）、牛血清蛋白（BSA）的非特异性吸附实时曲线变化图。图3多巴胺接枝两性离子聚合磷酸胆碱改性的I型胶原蛋白凝胶基质对软骨细胞培养的效果图。具体实施方式下面结合实施例和附图对本专利技术做进一步的详细说明。本专利技术基于两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白凝胶基质的制备方法合成路线示意图如图1所示：实施例11)多巴胺接枝两性离子聚合磷酸胆碱（DOPA-B）的制备：用十二水合磷酸氢二钠和磷酸二氢钾配制pH=7.4的10mM磷酸盐缓冲液。取1.2g两性离子聚合磷酸胆碱（B）溶于120mL上述磷酸盐缓冲液中，用1.0M盐酸将溶液的pH调至5，然后向溶液中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和两性离子聚合磷酸胆碱重复单元摩尔比为2：1），搅拌20min后加入多巴胺（多巴胺和两性离子聚合磷酸胆碱重复单元摩尔比为1：1），用1M盐酸将溶液的pH值维持在5，且在20℃下搅拌反应1小时。将反应后的溶液置于透析袋（MWCO：8000-14000Da）中，且在pH=5.0的水溶液中透析2天，再在去离子水中透析12h。将透析后的溶液冻干得到粉末状的产物（DOPA-B），于-20˚C下储存备用。2)I本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于多巴胺接枝两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白的凝胶基质的制备方法，其特征在于：（1）通过酰胺化反应将多巴胺接枝到两性离子聚合磷酸胆碱分子表面；（2）利用多巴胺氧化聚合时的粘附性，将两性离子聚合磷酸胆碱分子连接到I型胶原蛋白凝胶基质表面，其中多巴胺接枝两性离子聚合磷酸胆碱（DOPA-B）具有如下结构：

【技术特征摘要】
1.一种基于多巴胺接枝两性离子聚合磷酸胆碱改性I型胶原蛋白的凝胶基质的制备方法，其特征在于：（1）通过酰胺化反应将多巴胺接枝到两性离子聚合磷酸胆碱分子表面；（2）利用多巴胺氧化聚合时的粘附性，将两性离子聚合磷酸胆碱分子连接到I型胶原蛋白凝胶基质表面，其中多巴胺接枝两性离子聚合磷酸胆碱（DOPA-B）具有如下结构：。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其酰胺化反应合成多巴胺接枝改性两性离子聚合磷酸胆碱（DOPA-B）的制备方法：
a)将两性离子聚合磷酸胆碱（B）加入到pH=7.4的磷酸盐缓冲液中，常温下搅拌溶解；
b)按两性离子聚合磷酸胆碱与1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为2:1，往步骤a）所获溶液中加入1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐，反应20-30min；
c）按盐酸多巴胺与两性离子聚合磷酸胆碱重复单元摩尔比为1-3:1，加入盐酸多巴胺（DOPA），反应1-3h；
d)在去离子水中透析以...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔洪金，姜坤妤，陈明，苏荣欣，袁慧，黄仁亮，齐葳，
申请(专利权)人：关节动力安达天津生物科技有限公司，天津大学，
类型：发明
国别省市：天津;12