一种产业化制备BCG‑CpG‑DNA的方法技术

本发明专利技术公开一种产业化制备BCG‑CpG‑DNA的方法，包括菌体培养、菌体裂解、裂解液澄清、裂解液纯化和浓缩、浓缩液除菌分装，所述裂解液纯化是指利用Q Sepharose HP离子交换柱依次在TE缓冲体系、磷酸钠缓冲体系中将卡介菌菌体裂解液中卡介菌CpG‑DNA分离出来；所述浓缩指将经磷酸钠缓冲体系纯化所得的洗脱液经中空纤维柱进行浓缩后再进行缓冲液置换。本发明专利技术的两步法纯化体系所获得的卡介菌CpG‑DNA原液杂蛋白含量明显更低，其所占比例不超过1％，原液的纯度更高。且使用中空纤维系统进行超滤浓缩和缓冲液置换，达到浓缩BCG‑CpG‑DNA样品的目的。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用作治疗和预防用疫苗的佐剂的制备方法，具体涉及一种从卡介菌提取CpG-DNA(简称BCG-CpG-DNA)的产业化制备方法。
技术介绍
佐剂是疫苗中不可缺少的成分，在免疫佐剂方面，虽然铝佐剂的应用已有80年历史，其安全性也经过了长期应用的检验，但由于其对细胞免疫作用不明显，尤其对细胞免疫为主的疫苗，如对高纯化的第二代重组疫苗和第三代DNA疫苗，效果甚微，因此人们一直致力于新型佐剂的研究。近年来，CpG-DNA成为新型免疫佐剂的研究热点。除了人工合成的CpG寡核昔酸(CPGODN)之外，原核生物的DNA是CpG-DNA的主要来源。BCG-CpG-DNA是从卡介菌(BCG)中提取的菌体DNA片段，其富含未甲基化CpG基序，具有免疫刺激活性，可用作治疗和预防用疫苗中的佐剂。目前BCG-CpG-DNA的制备方法多使用有机溶剂酚、氯仿来除去多糖、蛋白等杂质，这些有机溶剂有毒，对环境有害且在产品中有残留；而专利201310586057.X公开了使用纯化缓冲液为TE缓冲体系或磷酸钠缓冲体系，通过离子交换的方法进行制备BCG-CpG-DNA。但其在小规模条件下制备的BCG-CpG-DNA中蛋白浓度最低为5.2μg/ml，而DNA浓度为124μg/ml，其杂质蛋白含量的比例约占4.2％，降低了DNA的纯度。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种产业化制备BCG-CpG-DNA的方法，采用两步纯化的方法，从BCG的菌体裂解液中纯化DNA(BCG-CpG-DNA)，杂质蛋白含量明显降低，该方法尤其适合产业化制备高纯度大分子量的BCG-CpG-DNA片段。本专利技术的技术方案为：一种产业化制备BCG-CpG-DNA的方法，包括菌体培养、菌体裂解、裂解液澄清、裂解液纯化和浓缩、浓缩液除菌分装，所述裂解液纯化是指利用QSepharoseHP离子交换柱依次在TE缓冲体系、磷酸钠缓冲体系中将卡介菌菌体裂解液中卡介菌CpG-DNA分离出来；所述浓缩指将经磷酸钠缓冲体系纯化所得的洗脱液经中空纤维柱进行浓缩后再进行缓冲液置换。进一步方案，所述离子交换柱在TE缓冲体系中进行分离时，先将卡介菌菌体裂解液加入第一上样缓冲液中；卡介菌裂解液上样后，再使用第一洗脱缓冲液进行梯度洗脱；所述第一上样缓冲液为0～0.5MNaCl+50mMTris(三羟甲基氨基甲烷)+1mMEDTA(乙二胺四乙酸)，pH为7.5～8.5；所述第一洗脱缓冲液为1MNaCl+50mMTris+1mMEDTA，pH7.5～8.5。更进一步，所述梯度洗脱是指先用质量分数为30％～50％的第一洗脱缓冲液进行洗脱，然后用质量分数为50％～100％的第一洗脱缓冲液继续洗脱。优选，所述第一上样缓冲液为0.5MNaCl+50mMTris+lmMEDTA，pH7.5；第一洗脱缓冲液为1MNaCl+50mMTris+lmMEDTA，pH7.5。优选，所述梯度洗脱是指先用质量分数为40％～45％的第一洗脱缓冲液进行洗脱，然后用质量分数为100％的第一洗脱缓冲液继续洗脱。进一步，所述离子交换柱在磷酸钠缓冲体系中进行分离时，先将注射用水加入经TE缓冲体系纯化后的洗脱液中，使其中的NaCl离子浓度达到0～0.5M；然后将其加入经第二上样缓冲液平衡后的QSepharoseHP离子交换柱进行上样，上样后，使用第二洗脱缓冲液进行梯度洗脱；所述第二上样缓冲液为0～0.5M氯化钠+50mM磷酸钠缓冲液，pH7.5～8.5；所述第二洗脱缓冲液为1M氯化钠+50mM磷酸钠缓冲液，pH7.5～8.5。进一步，所述第二上样缓冲液为0.5M氯化钠+50mM磷酸钠缓冲液，pH7.5；所述第二洗脱缓冲液为1M氯化钠+50mM磷酸钠缓冲液，pH7.5；所述梯度洗脱是指使用质量分数为60-100％的第二洗脱缓冲液进行洗脱。进一步，所述裂解液澄清是指经高速冷冻离心机在4℃条件下以8000～12000rpm/min离心10～20min，将其上清液收集并用去离子蒸馏水或离子交换分离用的洗脱缓冲液对其进行稀释1倍，最后用0.45～1μm的过滤器进行过滤。进一步，所述中空纤维柱将洗脱液浓缩至原体积的1/10～1/20，所述的缓冲液置换是指将置换缓冲液不间断的加入浓缩后的洗脱液中进行超滤处理；所述置换缓冲液为10mM磷酸盐缓冲液+质量分数为0.85～0.9％氯化钠，pH6.8～7.4。本专利技术在获得卡介菌菌体裂解液之后，利用QSepharoseHP离子交换柱从卡介菌裂解液中分离卡介菌CpG-DNA，其先在TE缓冲体系中进行，然后再在磷酸钠缓冲体系中进行，且此两种缓冲液的使用顺序不能改变，即：第一步纯化，在TE缓冲体系中进行分离，卡介菌CpG-DNA裂解液样品可采用如下的上样缓冲液：0～0.5MNaCl+50mMTris+1mMEDTApH7.5～8.5，优选上样缓冲液为0.5MNaCl+50mMTris+lmMEDTApH7.5；如下的洗脱缓冲液：1MNaCl+50mMTris+1mMEDTApH7.5～8.5，优选洗脱缓冲液为1MNaCl+50mMTris+lmMEDTApH7.5。上样后的洗脱采用梯度洗脱，梯度洗脱的方法为30％～50％所述洗脱缓冲液洗脱，继续50％～100％所述洗脱缓冲液洗脱，根据样品洗脱峰后，电导和紫外检测稳定后停止洗脱；优选40％～45％所述洗脱缓冲液洗脱，继续100％所述洗脱缓冲液洗脱；更优选45％所述洗脱缓冲液洗脱，继续100％所述洗脱缓冲液洗脱。第二步纯化，在磷酸钠缓冲体系中进行置换，将注射用水加入第一步纯化洗脱液，调整上样样品中的离子浓度，使其达到含有0～0.5MNaCl的效果。采用如下的上样缓冲液：0～0.5M氯化钠+50mM磷酸钠缓冲液，pH7.5～8.5，优选上样缓冲液为0.5M氯化钠+50mM磷酸钠缓冲液，pH7.5；如下的洗脱缓冲液:1M氯化钠+50mM磷酸钠缓冲液，pH7.5～8.5，优选洗脱缓冲液为1M氯化钠+50mM磷酸钠缓冲液，pH7.5。上样后的洗脱采用特定浓度洗脱，洗脱的方法为用50％～100％所述洗脱缓冲液洗脱，根据样品洗脱峰后，电导和紫外检测稳定后停止洗脱；优选60％所述洗脱缓冲液洗脱。破碎卡介菌菌体以获得菌体裂解液时所用的液体体系和稀释卡介菌裂解液时所用的液体体系，可以是注射用水，也可以是TE缓冲液，为了方便之后的分离纯化操作，优选使用的液体体系是分离纯化操作时所用的上样缓冲液或洗脱缓冲液。为了进一步得到更好的分离纯化效果，在分离纯化时，上样的卡介菌CpG-DNA裂解液样品中可以含有0～0.5MNaCl，优选含有0.5MNaCl，为了使经TE缓冲体系纯化后的洗脱液中，NaCl离子浓度达到0～0.5M，可以在菌体破碎裂解和稀释卡介菌菌体裂解液时使用相应的上样缓冲液。如果在菌体破碎裂解和稀释卡介菌菌体裂解液时使用的是注射用水，则可以在上样时采用相应的洗脱液稀释上样样品，以达到上样CpG-DNA裂解液样品中含有0～0.5MNaCl的效果。将经磷酸钠缓冲体系纯化的洗脱液经中空纤维柱进行浓缩与缓冲液置换，从而控制最终所获得样品的浓度、缓冲液离子浓度与pH。本专利技术使用中空纤维系统进行超滤浓缩和缓冲液置换，中空纤维系统的工作原理为：随着物料流被输送过纤维柱膜表面，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产业化制备BCG‑CpG‑DNA的方法，包括菌体培养、菌体裂解、裂解液澄清、裂解液纯化和浓缩、浓缩液除菌分装，其特征在于：所述裂解液纯化是指利用Q Sepharose HP离子交换柱依次在TE缓冲体系、磷酸钠缓冲体系中将卡介菌菌体裂解液中卡介菌CpG‑DNA分离出来；所述浓缩指将经磷酸钠缓冲体系纯化所得的洗脱液经中空纤维柱进行浓缩后再进行缓冲液置换。

【技术特征摘要】
1.一种产业化制备BCG-CpG-DNA的方法，包括菌体培养、菌体裂解、裂解液澄清、裂解液纯化和浓缩、浓缩液除菌分装，其特征在于：所述裂解液纯化是指利用QSepharoseHP离子交换柱依次在TE缓冲体系、磷酸钠缓冲体系中将卡介菌菌体裂解液中卡介菌CpG-DNA分离出来；所述浓缩指将经磷酸钠缓冲体系纯化所得的洗脱液经中空纤维柱进行浓缩后再进行缓冲液置换。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述离子交换柱在TE缓冲体系中进行分离时，先将卡介菌菌体裂解液加入第一上样缓冲液中，卡介菌裂解液上样后，再使用第一洗脱缓冲液进行梯度洗脱；所述第一上样缓冲液为0～0.5MNaCl+50mMTris(三羟甲基氨基甲烷)+1mMEDTA(乙二胺四乙酸)，pH为7.5～8.5；所述第一洗脱缓冲液为1MNaCl+50mMTris+1mMEDTA，pH7.5～8.5。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述梯度洗脱是指先用质量分数为30％～50％的第一洗脱缓冲液进行洗脱，然后用质量分数为50％～100％的第一洗脱缓冲液继续洗脱。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述第一上样缓冲液为0.5MNaCl+50mMTris+lmMEDTA，pH7.5；第一洗脱缓冲液为1MNaCl+50mMTris+lmMEDTA，pH7.5。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述梯度洗脱是指先用质量分数为40％～45％的第一洗脱缓冲液进行洗脱，然后用质量分数为1...

【专利技术属性】
技术研发人员：江秋虹，程琛舒，徐守腾，梁永培，卢荣江，吴宇杰，周沛，黄帅，蒲江，陶立峰，
申请(专利权)人：安徽智飞龙科马生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34