本发明专利技术涉及生物技术领域，特别涉及一种组合物、其应用以及含有该组合物的试剂盒。该组合物检测所用标本为血液，无创、方便获取且可大规模应用；主要基于数字PCR技术和Taqman探针，检测过程不依赖于扩增曲线的阈值(CT)进行定量，不受扩增效率的影响，无需依靠标准曲线来测定核酸量，而是直接数出DNA分子个数，大大简化操作步骤，有效节约了检测时间；对HBV pgRNA检测是绝对定量，显著有别于real‑time PCR方法的相对定量；所述的检测组合物在HBV pgRNA含量极低的样品检测中，通过微滴化处理可以有效的减少背景干扰和提高检测灵敏度，灵敏度可低至5个拷贝。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，特别涉及一种组合物、其应用以及含有该组合物的试剂盒。
技术介绍
乙型病毒性肝炎(hepatitisB，简称乙肝)系由乙肝病毒(HBV)引起，以乏力、食欲减退、恶心、呕吐、厌油、肝大及肝功能异常为主要临床表现。部分病例有发热和黄疸；少数病例病程迁延转为慢性，或发展为肝硬化甚至肝癌；重者病情进展迅猛可发展为重型肝炎；另一些感染者则成为无症状的病毒携带者。HBV-DNA定量检测指标降低在乙肝治疗中有着非常重要的意义，是乙肝转阴的前奏，也是康复最为关键的一步，只有体内的HBV-DNA定量指标降低，病毒的复制繁殖才会停止，乙肝的彻底治愈才有希望。乙肝病毒DNA检测的临床意义一、对医生的诊断和用药非常重要。通过乙肝病毒DNA检测能够判定判断乙肝患者适合用哪类抗病毒药物；乙肝病毒DNA检测对用药的剂量、用药时间、是否需要联合用药以及用药的效果等提供重要的参考依据，也是临床上评价抗病毒或免疫增强药物疗效的最客观的指标。乙肝病毒DNA检测的临床意义二、能够直接反映乙肝病毒复制状态及传染性的最佳指标，通过乙肝病毒DNA的含量能直接反映病毒在体内存在的数量、是否传染，传染性有多强。但是需要说明的一点是:乙肝病毒载量的多少并不代表肝脏的损伤程度，也无法判断病情的严重程度。乙肝病毒DNA检测的临床意义三、反映病毒复制的活跃程度，间接地反映机体的免疫应答水平。目前，实时荧光定量PCR(real-timePCR)是核酸(DNA或RNA)定量检测的主要方法。现已报道的乙型肝炎患者血液中HBVPgRNA的检测方法都是基于real-timePCR技术。但这种定量方法需要参考品、标准曲线以及内标校正，检测结果只是一个相对定量的结果，并不能够进行绝对定量，灵敏度也相对较低，尤其是对低拷贝数HBVPgRNA的定量仍存在一定的不足。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供一种组合物、其应用以及含有该组合物的试剂盒。该组合物能够对HBVpgRNA进行绝对定量，可以有效的减少背景干扰和提高检测灵敏度，灵敏度可低至5个拷贝。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种组合物，包括引物和探针，所述引物的序列如SEQIDNo.1～3所示；所述探针的序列如SEQIDNo.4所示。本专利技术还提供了所述的组合物在制备扩增和/或检测乙型肝炎病毒的试剂和/或试剂盒中的应用。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述乙型肝炎病毒为HBVpgRNA。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述扩增和/或检测为痕量扩增和/或痕量检测，所述检测的灵敏度为5个拷贝/mL。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述扩增和/或检测的反应体系为：或在本专利技术的一些具体实施方案中，所述扩增和/或检测的反应程序为：在本专利技术的一些具体实施方案中，扩增和/或检测乙型肝炎病毒具体为：由序列如SEQIDNo.2所示的上游引物、序列如SEQIDNo.3所示的下游引物和序列如SEQIDNo.4所示的探针定量检测HBVRNA(pgRNA+PreC-mRNA)，再由序列如SEQIDNo.1所示的上游引物、序列如SEQIDNo.3所示的下游引物和序列如SEQIDNo.4所示的探针定量检测PreC-mRNA，取HBVRNA和PreC-mRNA的定量结果之差获得HBVpgRNA的含量。HBVpgRNA结构特点：HBVpgRNA基因结构特殊，它的起始位置(nt1820)距离PreC-mRNA基因的起始位置(nt1788)较近，同时二者基因终点相同(图1)。因此，本专利技术提供的HBVpgRNA基因定量的策略是：先用引物2(上游引物)和引物3(下游引物)定量HBVRNA(pgRNA+PreC-mRNA)总量，再用引物1(上游引物)和引物3(下游引物)定量PreC-mRNA，两者定量结果之差即为pgRNA水平。本专利技术还提供了一种试剂盒，包括所述的组合物及分子生物学扩增中常用的助剂。本专利技术还提供了一种基于所述组合物或所述试剂盒的扩增和/或检测乙型肝炎病毒的方法，取待测样本获得HBV核酸混合物，去除DNA后，逆转录后经数字PCR，获得HBVpgRNA的含量；所述检测样本为血清或血浆。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述数字PCR具体为由序列如SEQIDNo.2所示的上游引物、序列如SEQIDNo.3所示的下游引物和序列如SEQIDNo.4所示的探针定量检测HBVRNA(pgRNA+PreC-mRNA)，再由序列如SEQIDNo.1所示的上游引物、序列如SEQIDNo.3所示的下游引物和序列如SEQIDNo.4所示的探针定量检测PreC-mRNA，取HBVRNA和PreC-mRNA的定量结果之差获得HBVpgRNA的含量。与现有技术相比，本专利技术所述的乙型肝炎患者血液中HBVPgRNA的检测组合物达到了如下效果：1、检测所用标本为血液，无创、方便获取且可大规模应用；2、所述的检测组合物主要基于数字PCR技术和Taqman探针，检测过程不依赖于扩增曲线的阈值(CT)进行定量，不受扩增效率的影响，无需依靠标准曲线来测定核酸量，而是直接采用数字PCR检测系统通过微滴化处理，直接数出DNA分子个数，大大简化操作步骤，有效节约了检测时间；3、所述的检测组合物对HBVpgRNA检测是绝对定量，显著有别于real-timePCR方法的相对定量；4、所述的检测组合物在HBVpgRNA含量极低的样品检测中，通过微滴化处理可以有效的减少背景干扰和提高检测灵敏度，灵敏度可低至5个拷贝，有效的克服了现有的基于real-timePCR技术的检测方法无法对低拷贝数HBVPgRNA进行定量的不足之处。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示HBVpgRNA的基因结构特点；图2示血液HBVpgRNA定量检测流程图；图3示灵敏度检测结果；图4示特异性检测结果；其中，图4(A)示ddPCR法检测特异性样品的浓度图；图4(B)示ddPCR法检测特异性样品的阳性微滴图。具体实施方式本专利技术公开了一种组合物、其应用以及含有该组合物的试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。本专利技术提供的技术方案具体如下：一、引物及探针的设计：1.HBVpgRNA结构特点：HBVpgRNA基因结构特殊，它的起始位置(nt1820)距离PreC-mRNA基因的起始位置(nt1788)较近，同时二者基因终点相同(如图1所示)。因此，HBVpgRNA基因定量的策略是：先用引物2(上游引物)和引物3(下游引物)定量HBVRNA(pgRNA+PreC-mRNA)总量，再用引物1(上游引物)和引物3(下游引物)定量PreC-mRNA，两者定量结果之差即为pgRNA水平。2.HBV基因型有A-J9种基因型，在我国以B、C基因型为主，同时存在部分A、D基因型。从GenBank数据库中下载多条A～D基因型本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种组合物，其特征在于，包括引物和探针，所述引物的序列如SEQ ID No.1～3所示；所述探针的序列如SEQ ID No.4所示。
【技术特征摘要】
1.一种组合物，其特征在于，包括引物和探针，所述引物的序列如SEQIDNo.1～3所示；所述探针的序列如SEQIDNo.4所示。2.根据权利要求1所述的组合物在制备扩增和/或检测乙型肝炎病毒的试剂和/或试剂盒中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述乙型肝炎病毒为HBVpgRNA。4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述扩增和/或检测为痕量扩增和/或痕量检测，所述检测的灵敏度为5个拷贝/mL。5.根据权利要求2至4任一项所述的应用，其特征在于，所述扩增和/或检测的反应体系为：或6.根据权利要求2至5任一项所述的应用，其特征在于，所述扩增和/或检测的反应程序为：7.根据权利要求2至6任一项所述的应用，其特征在于，扩增和/或检测乙型肝炎病毒具体为：由序列如SEQIDNo.2所示的上游引物、序列如SEQIDNo.3所示的下游引物和序列如SEQIDNo.4所示的探针定量检测HBVRNA，再由序列如SEQIDNo.1所示的上游引物、序列如SEQIDNo.3...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡鹏，李虎，汤慧，彭明利，任红，
申请(专利权)人：重庆医科大学附属第二医院，
类型：发明
国别省市：重庆;50
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