鹅源呼肠孤病毒灭活疫苗的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种鹅源呼肠孤病毒灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：将呼肠孤病毒经尿囊腔接种鹅胚，孵育后收集24～144小时内死胚或活胚尿囊液，获得病毒液；将所述病毒液经甲醛灭活，加入Tween‑80混合作为水相，以白油、Span‑80和硬脂酸铝混合作为油相，将水相加入到油相混合均匀，得到灭活疫苗。本发明专利技术制备的鹅源呼肠孤病毒灭活疫苗对雏鹅有较高的保护效力，适用于对雏鹅的病毒免疫。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于兽医疫苗
，尤其涉及一种鹅源呼肠孤病毒灭活疫苗的制备方法。
技术介绍
鹅呼肠孤病毒感染是由鹅呼肠孤病毒引起的一种鹅病毒性传染病。呼肠孤病毒科(Reovirdae)包括正呼肠孤病毒属(Orthoreovirus)，轮状病毒属(Rotavirus)，环状病毒属(orbivirus)，质型多角体病毒属(Cypovirus)，植物呼肠孤病毒属(Phytoreovirus)和斐济病毒属(Fijivirus)。正呼肠孤病毒属是一大群具有囊膜的双链RNA病毒，目前研究表明，引起鹅感染发病的为呼肠孤病毒科，正呼肠孤病毒属亚群II的鹅呼肠孤病毒。鹅呼肠孤病毒感染的流行无明显季节性，发生于1周龄至10周龄的雏鹅和仔鹅，多发生于2～4周龄的雏鹅。发病率和死亡率与日龄有密切的关系，差异较大。发病率为10％～70％，日龄越小发病率越高，死亡率为2％～60％，3周龄内雏鹅感染后死亡率较高，7～10周龄仔鹅感染后死亡率低。该病可垂直传播和水平传播。粪便污染是接触污染的主要来源。病鹅多精神萎顿，食欲大减或废绝，羽毛杂乱无光泽，体弱，消瘦，行动迟缓或跛行，一侧或两侧跖关节或跗关节肿胀。急性发病表现为脾炎，脾脏有粟粒状坏死灶。亚急性或慢性期发病鹅表现为心包炎，关节炎和腱鞘炎。应用灭活疫苗进行免疫，是预防控制该病的有效措施之一。目前，针对鹅呼肠孤病毒尚没有比较好的疫苗。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种鹅源呼肠孤病毒灭活疫苗的制备方法，本专利技术提供的方法制备的鹅源呼肠孤病毒灭活疫苗能够预防和控制鹅呼肠孤病毒感染。本专利技术提供了一种鹅源呼肠孤病毒灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：将呼肠孤病毒经尿囊腔接种鹅胚，孵育后收集24～144小时内死胚或活胚尿囊液，获得病毒液；将所述病毒液经甲醛灭活，加入Tween-80混合作为水相，以白油、Span-80和硬脂酸铝混合作为油相，将水相加入到油相混合均匀，得到灭活疫苗。优选的，所述鹅胚为12日龄鹅胚。优选的，所述呼肠孤病毒的接种量为每枚0.2mL。优选的，所述孵育的温度为37℃。优选的，所述病毒液经甲醛灭活具体为：所述病毒液与甲醛混合，37℃静置36h，以硫代硫酸钠终止反应。优选的，所述甲醛的浓度为0.2wt％；所述硫代硫酸钠的浓度为2wt％。优选的，所述水相中Tween-80的终浓度为4wt％。优选的，所述白油、Span-80和硬脂酸铝的比例为94:6:2。优选的，所述油相和水相的质量比为2:1。优选的，所述油相和水相混合的搅拌速度为3000转/min，时间为30min。具体而言，本专利技术按照以下方法制备灭活疫苗并对其进行检验：1、油乳剂灭活疫苗的制备将呼肠孤病毒分离株经尿囊腔接种12日龄健康鹅胚，每枚0.2mL，37℃孵育，弃掉24h内死胚，收集24～144小时内死胚或者活胚尿囊液，分装保存于-80℃备用。将尿囊液以终浓度0.2％甲醛灭活，置于37℃36h，以2％硫代硫酸钠终止反应。加入灭菌的Tween-80，终浓度4％，混合后作为水相。以白油，Span-80，和硬脂酸铝混合作为油相，3000转的转速下将水相缓慢倒入油相中混匀，油水比为2：1，搅拌30分钟，得到灭活疫苗，并作相关质量鉴定。2、兔抗鹅HRP酶标二抗的制备将鹅血清经饱和硫酸铵法提纯，多次免疫新西兰兔。得到的兔血清按饱和硫酸铵法提纯。利用高碘酸钠法对提纯抗体进行HRP标记，用分光光度计检测OD280nm和OD403nm进行质量鉴定。3、ELISA检测程序1包被将病毒尿囊液按照100μL/孔包被96孔酶标板，4℃过夜；2洗板包被的酶标板按照200μL/孔加入PBST稀释液，震荡洗涤5分钟，重复四次，甩干。3封闭甩干的酶标板按照200μL/孔加入封闭液封闭，37℃孵育1h，震荡洗涤5分钟，重复四次，甩干。4加样用PBST稀释液将待检样品稀释10倍，按照100μL/孔加入甩干后的酶标板，置于37℃孵育1h，震荡洗涤5分钟，重复四次，甩干。5检测抗体将酶标抗体用PBST稀释液按照体积比1:800稀释后，按照100μL/孔加入酶标板，37℃孵育1h，震荡洗涤5分钟，重复四次，甩干。6TMB显色加入TMB显色液，每孔100μL，37℃避光显色15分钟。7终止每孔加入50μL2MH2SO4终止液终止显色反应，在酶标仪上读取各孔反应液OD450nm的值。f、阳性临界值的确定根据公式：阴阳性临界值＝阴性样本OD450平均值+3SD(标准偏差)，得到阴阳性临界值为0.386。当OD450nm在0.387以上，可判断为阳性，即待检样品中含有呼肠孤病毒。本专利技术制备的鹅源呼肠孤病毒灭活疫苗对雏鹅有较高的保护效力，适用于对雏鹅的病毒免疫。具体实施方式实施例本专利技术中所用试剂及其组分如下：包被缓冲液：1×碳酸盐缓冲液(100mL，pH＝9.6)：Na2CO30.2756g，NaHCO30.6216g，用蒸馏水溶解并定容至100mL，pH值9.5-9.7，4℃保存；PBS溶液：NaCl4.25g，NaH2PO4·2H2O0.178g，Na2HPO4·12H2O1.386g，用蒸馏水溶解并定容至500mL，pH值7.1-7.3；PBST稀释液：每1LPBS加入Tween-200.5mL，充分混匀；PBST封闭液：将5gdrymilk溶解于100mLPBST稀释液中，短期保存于4℃，长期保存于-20℃。TMB显色液：BufferA：称取66.5063g柠檬酸钾，用800mL四蒸水溶解并用浓盐酸调节pH值至4.0，加入314μLH2O2，用水定容至1L。4℃保存；BufferB：称取0.2956g四甲基联苯胺(TMB)，0.0633g四丁基硼氢化铵(TBABH)溶于30mL二甲基乙酰胺(DMA)，4℃避光保存；使用时，将BufferA和BufferB以体积比39：1的比例混合，现配现用；2MH2SO4终止液：将浓H2SO4以体积比1:10的比例加入蒸馏水中，混匀冷却至室温即为2M硫酸溶液。NaIO4溶液(60mmol/L)：称取1.283gNaIO4用蒸馏水定容至100mL。乙二醇(160mmol/L)：量取13.4uL乙二醇用水稀释至1.5mL。NaBH4溶液(5mg/mL)：取0.05gNaBH4用水定容至10mL，先配现用。饱和硫酸铵溶液(PH7.4)：每100mL水中加90g硫酸铵，加热溶解，趁热过滤，冷却后调pH。本专利技术所用呼肠孤病毒分离株为保存于山东农业大学动物科技学院禽病学研究室的呼肠孤病毒。实验过程：1、抗原的制备将呼肠孤病毒分离株经尿囊腔接种12日龄健康鹅胚，每枚0.2mL，37℃孵育，弃掉24h内死胚，收集24～144小时内死胚或者活胚尿囊液，分装保存于-80℃备用。2、灭活疫苗的制备将步骤1获得的病毒液以终浓度0.2％甲醛灭活，置于37℃36h，以2％硫代硫酸钠终止反应。加入灭菌的Tween-80，终浓度4％，混合后作为水相。以白油，Span-80，和硬脂酸铝混合作为油相，3000转的转速下将水相缓慢倒入油相中混匀，油水比为2：1，搅拌30分钟，得到灭活疫苗。对所述灭活疫苗进行质量鉴定：无菌检验：将试制样品取一滴分别滴入普通琼脂培养基和营养肉汤中，混匀后在37℃下培养24h，无微生物生长。稳定性检验：本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鹅源呼肠孤病毒灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：将呼肠孤病毒经尿囊腔接种鹅胚，孵育后收集24～144小时内死胚或活胚尿囊液，获得病毒液；将所述病毒液经甲醛灭活，加入Tween‑80混合作为水相，以白油、Span‑80和硬脂酸铝混合作为油相，将水相加入到油相混合均匀，得到灭活疫苗。

【技术特征摘要】
1.一种鹅源呼肠孤病毒灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：将呼肠孤病毒经尿囊腔接种鹅胚，孵育后收集24～144小时内死胚或活胚尿囊液，获得病毒液；将所述病毒液经甲醛灭活，加入Tween-80混合作为水相，以白油、Span-80和硬脂酸铝混合作为油相，将水相加入到油相混合均匀，得到灭活疫苗。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述鹅胚为12日龄鹅胚。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述呼肠孤病毒的接种量为每枚0.2mL。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述孵育的温度为37℃。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述病毒液经甲...

【专利技术属性】
技术研发人员：刁有祥，张秉乾，唐熠，陈浩，窦砚国，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37