来自红海卤池生物的DNA聚合酶制造技术

用于扩增核酸的DNA聚合酶组合物可以耐受极端条件。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】优先权要求本申请要求2014年4月11日提交的美国临时申请号61/978,406的优先权，其全部内容通过引用并入本申请。序列表本申请包含已以ASCII格式的电子版提交的序列表并且其全部内容通过引用并入本申请。2015年10月14日创建的所述ASCII副本的文件名为18605.0094PCT_SL.txt，文件大小为53,211字节。专利
本专利技术涉及DNA聚合酶。背景聚合酶链式反应(PCR)是一种用于快速和指数级扩增目标核酸序列的方法。已发现其在基因表征和分子克隆技术中具有多种用途，包括对PCR扩增DNA的直接测序、确定等位基因变体和检测感染性和遗传疾病。已将多种热稳定的DNA聚合酶用于PCR应用；例如从水生栖热菌(Thermusaquaticus，Taq)中分离的TaqDNA聚合酶、来源于激烈热球菌(Pyrococcusfuriosus)的pfu聚合酶、从Thermococcuskodakaraensis中分离的KOD聚合酶以及从嗜热高温球菌(Thermococcuslitoralis，Tli)中分离的VentTMDNA聚合酶。参见例如美国专利号6,008025、美国专利号5,545,552和美国专利号5,489,523，其全部内容均通过引用并入本申请。概述在一个方面，提供了一种用于扩增核酸的DNA聚合酶组合物，所述DNA聚合酶组合物包含分离的DNA聚合酶，所述分离的DNA聚合酶具有与SEQIDNO:1-4所示的序列具有至少80％同源性的氨基酸残基。可以从卤池嗜热古细菌物种中分离该聚合酶。该聚合酶可以与从嗜热高温球菌中分离的DNA聚合酶具有约40％的序列同源性。在某些实施方式中，在存在浓度高达300mM的氯离子的条件下该聚合酶保持其最佳DNA聚合酶活性的至少100％。其活性随着氯离子浓度的增加而增加，300mM是最佳浓度。在某些实施方式中，在存在浓度高达300mM的硫酸根离子的条件下该聚合酶保持其最佳DNA聚合酶活性的至少50％。其活性随着硫酸根离子浓度的增加而增加，100mM是最佳浓度并且在硫酸盐浓度为300mM时活性降至50％。在某些实施方式中，在存在浓度高达250mM的谷氨酸钾的条件下该聚合酶保持其最佳DNA聚合酶活性的100％。其活性随着谷氨酸钾浓度的增加而增加，250mM是最佳浓度。在某些实施方式中，在存在浓度高达1mM的Zn2+离子的条件下该聚合酶保持其最佳DNA聚合酶活性的至少50％。在Zn2+离子浓度为0.5mM时其活性是最佳的并且在1mM时降至50％。在某些实施方式中，在存在浓度高达100mM的Mg2+离子的条件下该聚合酶保持其DNA聚合酶活性的100％。其活性随着Mg2+离子浓度的增加而增加，100mM是最佳浓度。在某些实施方式中，该聚合酶的DNA延伸速率大于每秒450个碱基。在某些实施方式中，该聚合酶具有每个DNA结合事件循环平均2000个碱基的DNA延伸持续合成能力。在某些实施方式中，该聚合酶的DNA校正活性是pfu聚合酶活性的至少2倍。在某些实施方式中，在65℃下加热15分钟后，该聚合酶保持其稳定性的100％。在某些实施方式中，该聚合酶在室温下具有活性。在某些实施方式中，在7.5-9.0的pH条件下，该聚合酶保持其DNA聚合酶活性的100％。在另一个方面，提供了一种用于扩增核酸的方法，所述方法包括将作为模板的DNA、引物、dNTP和DNA聚合酶组合物反应，并且延伸引物以合成DNA引物延伸产物。在另一个方面，提供了一种用于扩增核酸的方法，其中的聚合酶具有在盐和金属离子浓度较高以及存在不同类型金属离子的条件下延伸DNA的能力，能够利用其改进当前可用的分子生物学、生物化学和生物物理技术。在另一个方面，提供了一种用于扩增核酸的试剂盒，所述试剂盒含有DNA聚合酶组合物。在另一个方面，提供了一种载体，所述载体可以包含编码DNA聚合酶的基因。在另一个方面，提供了一种质粒，所述质粒可以包含编码用于形成DNA聚合酶重组体的基因。其他方面、实施方式和特征从下文的说明书、附图和权利要求中将是显而易见的。附图简述图1A是比较在不同盐浓度下BR3聚合酶和pfu聚合酶活性的图像。在这些实验中使用的盐是NaCl。BR3和pfu的浓度是50nM。图1B是在不同盐浓度下KOD聚合酶活性的图像。在这项实验中使用的盐是KCl和KOD的浓度是50nM。图2A-2C是比较在存在不同盐的条件下BR3聚合酶和pfu聚合酶活性的图像。在这些实验中使用的盐是：KCl(2A)、NH4(SO)4(B)和谷氨酸钾(C)。BR3和pfu的浓度是50nM。图3A-3C是比较在存在不同金属离子的条件下BR3聚合酶和pfu聚合酶活性的图像。在(A)和(B)中使用的金属离子的浓度是MgCl2、MnCl2、CaCl2、ZnSO4、LiCl均为1mM。BR3和pfu的浓度是50nM。图4A是比较在存在不同浓度Mg2+的条件下BR3聚合酶和pfu聚合酶活性的图像。BR3和pfu的浓度是50nM。图4B是在存在不同浓度Mg2+的条件下KOD聚合酶活性的图像。图5是比较BR3聚合酶和pfu聚合酶校正活性的图像。图5按照出现的先后顺序分别公开了SEQIDNO7-11。图6是显示用于检测BR3和pfu聚合酶速率和持续合成能力的单分子测定的图像和曲线以及显示BR3和pfu聚合酶合成DNA的速率和持续合成能力的柱状图。图7是显示BR3聚合酶热稳定性的图像。图8是显示BR3聚合酶ddNTP掺入效率和对其活性位点进行工程改造以掺入ddNTP的策略的图像。图8按照出现的先后顺序分别公开了SEQIDNO12和13。图9表示BR1、BR2、BR3和BR6聚合酶的序列。图10表示BR3聚合酶开放阅读框架的序列(核苷酸序列如SEQIDNO:14，氨基酸序列如SEQIDNO:3所示)。图11表示BR3(SEQIDNO:3)、KOD(SEQIDNO:15)、Pfu(SEQIDNO:16)和Tli(SEQIDNO:17)聚合酶的一级序列比对。根据在DNA聚合酶中的共同结构域结构对序列的颜色高亮显示，在催化中的关键氨基酸以加粗的红色和蓝色表示以及与聚合酶结构的热稳定性相关的半胱氨酸残基以加粗的黄色表示。详细描述红海的深海缺氧盐水被认为是地球上最偏远、最具挑战性和最极端的环境之一，同时仍是研究最少的区域之一。目前已知约有25个这样的填充有盐水的池，其均是缺氧、高盐度的深海水体，具有升高的温度、重金属浓度，其具有与覆盖的海水形成特征性尖锐的梯度丰富的界面的不同类型的金属离子。参见BackerH&SchoellM(1972)NewdeepswithbrinesandmetalliferoussedimentsinRedSea.Nature-PhysicalScience240(103):153，和HartmannM,ScholtenJC,StoffersP,&WehnerF(1998)Hydrographicstructureofbrine-filleddeepsintheRedSea-newresultsfromtheShaban,Kebrit,AtlantisII,andDiscoveryDeep.MarGeol144(4):311-330，其全本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于扩增核酸的DNA聚合酶组合物，所述组合物包含：分离的DNA聚合酶，所述分离的DNA聚合酶与SEQ ID NO:1‑4所示的序列具有至少80％的同源性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.04.11 US 61/978,4061.一种用于扩增核酸的DNA聚合酶组合物，所述组合物包含：分离的DNA聚合酶，所述分离的DNA聚合酶与SEQIDNO:1-4所示的序列具有至少80％的同源性。2.一种用于扩增核酸的方法，所述方法包括：将作为模板的DNA、引物、dNTP和权利要求1所述的DNA聚合酶组合物反应，并延伸所述引物以合成DNA引物延伸产物。3.一种用于扩增核酸的试剂盒，其包含权利要求所述的DNA聚合酶组合物。4.一种载体，其包含编码权利要求1所述DNA聚合酶的基因。5.一种利用卤池(Brinepool)分离DNA聚合酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：SM哈姆丹，M塔卡哈什，
申请(专利权)人：阿卜杜拉国王科技大学，
类型：发明
国别省市：沙特阿拉伯;SA