百里香酚在制备治疗沙门氏菌感染药物中的应用制造技术

本发明专利技术提供了百里香酚在制备治疗沙门氏菌感染药物中的应用，以人宫颈癌细胞(Hela)为感染载体，通过庆大保护性实验、体外生化实验以及小鼠沙门氏菌感染模型均证实百里香酚通过影响Ⅲ型分泌系统的功能，从而对沙门氏菌感染有显著的抑制作用。抗生素在治疗沙门氏菌感染的过程中，易诱导耐药性的产生，对比抗生素治疗，中药化合物百里香酚可以直接抑制沙门氏菌Ⅲ型分泌系统的功能而发挥抗感染的作用，并且不易诱导耐药性的产生，具有治愈率高的特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及百里香酚在制备治疗沙门氏菌感染药物中的应用，属于医药领域。
技术介绍
沙门氏菌是引发人类和动物食物中毒的首要食源性病原菌之一，也是在全球公共卫生学上有重要意义的人兽共患病原菌。该病原菌在自然界有广泛的宿主谱，绝大多数对人和动物均适应。沙门氏菌感染动物后常导致严重的疾病，主要侵害低龄动物，导致伤寒、败血症、胃肠炎及其他组织局部炎症，并可引起怀孕母畜流产和死胎等致死性感染，其中危害比较严重的有鸡白痢、猪败血症、肠炎及副伤寒，给畜禽养殖业带来严重的经济损失，甚至严重威胁公共健康和食品安全。目前针对沙门氏菌感染，普遍采用抗生素进行治疗，但由于抗生素的长期使用和滥用及其不可避免的易诱导耐药性等因素导致了沙门氏菌耐药性日益严重，耐药谱逐渐加宽。这一现象对于临床上沙门氏菌感染的治疗更是雪上加霜。因此临床上迫切需要寻求新的抗感染策略及药物来预防和治疗沙门氏菌感染。近年来研究发现病原菌的致病力与其分泌的各种毒力蛋白或效应蛋白密切相关，但上述蛋白分子不是细菌生命所必需成分。因此，以细菌特异性用于感染宿主细胞的蛋白或者蛋白复合物为靶标的药物，不仅可发挥抗感染作用，且其对细菌产生的选择压力小，不易诱导耐药性。Ⅲ型分泌系统(T3SS)广泛的分布于革兰氏阴性细菌中，其主要功能是分泌和转运病原菌毒力因子。对于沙门氏菌，其致病力便是通过两套T3SS系统分泌效应蛋白，分别介导细菌侵入和在胞内的增殖，在其致病过程中起着决定性作用。本研究以沙门氏菌Ⅲ型分泌系统为药物靶标，发现天然化合物百里香酚显著抑制沙门氏菌Ⅲ型分泌系统的分泌功能。从体内外研究发现，百里香酚显著抑制沙门氏菌内化入细胞的水平并且对沙门氏菌感染小鼠保护率高达70％。为畜禽养殖降低或替代抗生素的应用和临床上有效防治沙门氏菌及其它革兰氏阴性菌感染提供新的研发策略和先导化合物。百里香酚(Thymol)，主要存在于百里香草、麝香草、牛至全草、香青兰全草等植物中，具有多种药理学活性，如局麻、祛痰、抗炎、驱虫等药理作用。在临床医学占用重要的地位。但是目前国内外未见百里香酚通过抑制沙门氏菌Ⅲ型分泌系统的功能而达到抗沙门氏菌感染的报道。
技术实现思路
百里香酚(Thymol)的分子结构如下：本研究以沙门氏菌Ⅲ型分泌系统为药物靶标，发现天然化合物百里香酚显著抑制沙门氏菌Ⅲ型分泌系统的分泌功能。从体内外研究发现，百里香酚显著抑制沙门氏菌内化入细胞的水平并且对沙门氏菌感染小鼠保护率高达70％。为畜禽养殖降低或替代抗生素的应用和临床上有效防治沙门氏菌及其它革兰氏阴性菌感染提供新的研发策略和先导化合物。本专利技术通过人宫颈癌细胞(Hela)损伤的保护性试验以及小鼠沙门氏菌感染模型证实其在抗沙门氏菌感染中的作用。附图说明附图1：百里香酚对沙门氏菌生长的影响(横轴为细菌的生长时间，纵轴为细菌的OD600nm值)附图2：百里香酚显著抑制沙门氏菌Ⅲ型分泌系统的功能(WT为野生型沙门氏菌，Δinva为Ⅲ型分泌系统缺失株，WT+0.2mMthymol为用0.2mM的药物浓度处理后的沙门氏菌)附图3：百里香酚显著抑制沙门氏菌内化宿主细胞(WT为野生型沙门氏菌，Δinva为Ⅲ型分泌系统缺失株，ΔsipA为效应蛋白sipA缺失后的菌株，WT+0.2mMthymol为用0.2mM的药物浓度处理后的沙门氏菌)附图4：百里香酚沙门氏菌感染小鼠有显著的保护作用(横轴为感染的时间，纵轴为死亡率。thymol单纯的药物组，Δinva为感染Ⅲ型分泌系统缺失株，WT+thymol为百里香酚治疗组，WT为感染野生型沙门氏菌)附图5：百里香酚抑制沙门氏菌感染小鼠引起的体重下降(横轴为感染时间，纵轴为体重变化)附图6：百里香酚缓解沙门氏菌感染小鼠的盲肠组织病变(上图：眼观病理变化；下图：病理组织切片观察；)附图7：百里香酚对沙门氏菌感染小鼠靶器官菌落定殖量计数的检测(横轴为盲肠、肝脏和脾脏的不同的处理组，纵轴为菌落定殖情况)附图8：百里香酚对沙门氏菌感染小鼠肠道炎症因子检测(横轴为不同的处理组，纵轴为不同细胞因子的含量)附图9：蛋白质谱方法分析百里香酚对沙门氏菌Ⅲ型分泌系统的影响附图10：体外生化手段验证百里香酚影响沙门氏菌Ⅲ型分泌系统多种效应蛋白附图11：点击化学方法验证百里香酚直接结合于效应蛋白SipA的两部分区域附图12：圆二色谱分析百里香酚影响了效应蛋白SipA二级构像(横轴吸收波长，纵轴为毫度)附图13：体外生物化学方法验证蛋白酶Lon酶解了二级构像发生变化的效应蛋白SipA具体实施方式1.沙门氏菌III型分泌系统抑制剂的筛选以β-内酰胺酶-SipA融合及其荧光底物CCF-4检测受试化合物对Ⅲ型分泌系统功能的影响。2.百里香酚对沙门氏菌生长的影响将沙门氏菌于LB(含0.3MNaCl)液体培养基内过夜培养(37℃，200rpm),1:100扩大培养至OD600nm值为0.1左右，分别设定阳性组和不同浓度的药物处理组。继续培养，并且没隔30min测定其各个样品的光密度值，直至平台期。实验结果表明：百里香酚在0.6mM的药物浓度下出现亚抑菌的想象，但是0.4mM药物浓度下并不影响细菌的生长。(见附图1)。3.验证百里香酚抑制Ⅲ型分泌系统分泌功能将含有报告系统的菌株和百里香酚共同孵育培养4h，以Hela细胞为载体，以MOI＝20感染宿主细胞30min，使用PBS清洗细胞三次，随后加入CCF4荧光底物观察感染细胞的颜色变化，并且使用流式细胞仪定量眼观结果。分别设定为野生株组(WT)、药物处理组(WT+0.2mMthymol)、阴性对照Ⅲ型分泌系统缺失株组(Δinva)。实验结果表明：百里香酚显著抑制沙门氏菌Ⅲ型分泌系统的功能。从流式细胞图可知，百里香酚处理后，沙门氏菌Ⅲ型分泌系统执行分泌的功能显著下降(从88％降致3.03％)(见附图2)。4.百里香酚对沙门氏菌感染宿主细胞的保护作用将百里香酚与沙门氏菌共同孵育培养4h，分别设定沙门氏菌野生株组、ΔsipA缺失株组、ΔinvA缺失株组和药物处理组。以相同方式感染细胞大约30min，4％甲醛固定细胞，荧光标记胞外细胞，透化处理后，荧光标记胞内和胞外细胞。激光共聚焦显微镜下观察，不同处理组细胞内化的菌量变化(即胞内和胞外染色实验)。实验结果表明：药物处理后沙门氏菌侵染宿主细胞的能力显著下降并且呈现药物梯度性，在0.2mM的药物浓度下其几乎丧失了侵染细胞的能力与ΔinvA缺失株组相当(见附图3)。5.百里香酚对小鼠沙门氏菌感染的保护作用5.1建立小鼠沙门氏菌感染模型应用链霉素处理6-8周龄小鼠，感染前对其禁水6h，采用口服感染的方式灌服沙门氏菌，建立小鼠感染沙门氏菌肠炎模型。5.2保护率实验应用链霉素处理6-8周龄小鼠，并于感染前1天给予百里香酚(100mg/kg)。感染前对预处理小鼠禁水6h，以106的菌量感染小鼠同时给予百里香酚(100mg/kg)进行药物治疗，分别于感染后1-10天内统计不同处理组小鼠的体重变化。分别设定为沙门氏菌感染组(WT)、药物治疗组(WT+thymol)、Ⅲ型分泌系统缺失株感染组(Δinva)和药物对照组(thymol)。实验结果表明：沙门氏菌感染小鼠在第五天开始出现死亡，在第六天和第七的死亡率分别为80％和100％。而药物处理组小鼠在第七天开始本文档来自技高网...

【技术保护点】
百里香酚在制备治疗沙门氏菌感染药物中的应用。

【技术特征摘要】
1.百里香酚在制备治疗沙门氏菌感染药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的药物中的百里香酚，包括其药学上可接受的各种载体。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，百里...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓旭明，罗招庆，张勇，刘雁，冯海华，王建锋，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22