用于乳糜泄的口服酶疗法的甲基丙烯酸透明质酸衍生物的水凝胶制造技术

本发明专利技术涉及包含来自官能化的透明质酸衍生物的水凝胶的组合物，所述水凝胶负载有选自由脯氨酰内肽酶(PEP)和内切蛋白酶(EP)组成的组的外源酶，所述组合物意图用于乳糜泻的口服治疗。具体地，本发明专利技术涉及可用于制备透明质酸的甲基丙烯酸衍生物的一锅法，所述一锅法通过在透明质酸的羟基上形成特定活性基团，然后用乙二胺取代插入的活性基团，最后与甲基丙烯酸酐反应。获得的甲基丙烯酸透明质酸衍生物被用于通过辐照制备水凝胶并且被负载有选自由脯氨酰内肽酶(PEP)和内切蛋白酶(EP)组成的组的外源酶。证明了制备的水凝胶允许酶在模拟胃肠液中以活性形式释放的能力。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利
本专利技术涉及包含负载有至少一种外源酶的透明质酸衍生物水凝胶的药物组合物，所述酶选自由脯氨酰内肽酶(PEP)、内切蛋白酶(EP)及其组合组成的组；所述组合物意图用于乳糜泄的口服治疗。现有技术乳糜泄是在遗传易感个体中由麦胶(gluten)诱导的小肠病理学，尽管环境因素也参与此复杂的炎性疾病。麦胶是麦胶蛋白(gliadin)和麦谷蛋白(glutenin)的混合物，富含脯氨酸和谷氨酰胺，脯氨酸和谷氨酰胺不是人类胃肠道的酶的优选的底物。因此，麦胶在人类中不完全降解，产生高达30-40个氨基酸的亚稳态的免疫原性肽。特别地，α2-麦胶蛋白即一种代表性的麦胶蛋白的序列在胃中被胃蛋白酶裂解，形成大的肽，所述大的肽在小肠腔中被肠刷状缘膜(intestinalbrushbordermembrane)的胰蛋白酶和胰肽酶消化成用于吸收的单个氨基酸、二肽和三肽。然而，33聚体序列经过消化仍然存在，直到穿过上皮屏障，在选择的谷氨酰胺残基处由谷氨酰胺转移酶2(TG2)脱氨。在下方的固有层中，衍生自脱氨的33聚体的表位示出对人类白细胞抗原(HLA)DQ2的高亲和力。抗原呈递细胞(APC)表面上的脱氨的麦胶肽-DQ2复合物引发来自麦胶-特异性肠T细胞的强大的炎性应答，该炎性应答导致破坏肠结构、营养素吸收不良、腹泻和贫血。完全无麦胶的饮食能够解决多数患者中的乳糜泄的体征和症状，并且到目前为止，是用于此病理学的唯一的治疗。显然，由于人类饮食中麦胶无处不在，此限制是一个困难的经历并且通常带来生活质量降低。另外，无麦胶的食物非常昂贵，因此，除了不佳的口感以外，经济原因经常使患者望而却步。不幸的是，对严格的无麦胶饮食的自愿的或非自愿的不良的患者依从性引起可以与增加的发病率和死亡率相关的并发症，诸如骨质疏松症、继发性免疫紊乱(secondaryimmunedisorder)、恶性肿瘤等。因此，存在对于对无麦胶饮食的治疗替代方案的极大需求，其中包括外源脯氨酰内肽酶(PEP)的口服施用。与人类的胃肠道酶不同，外源PEP可以高效地水解富含脯氨酸的麦胶肽，并且随后避免炎性应答。对于此目的已经提出多种PEP，诸如来源于脑膜炎脓毒性黄杆菌(Flavobacteriummeninosepticum)(FM)、黄色粘球菌(Myxococcusxanthus)(MX)、Sphingomonascapsulata(SC)和黑曲霉(Aspergillusniger)(AN)的PEP，所述PEP具有不同的序列和链长特异性和在酸性介质中或在胃肠蛋白酶的存在下的稳定性(BethuneMT和KhoslaC.Oralenzymetherapyforceliacsprue.MethodsEnzymol.2012；502:241-271)。然而，对于这些酶的口服施用，需要选择允许不改变酶的制造方法和酶在胃和/或肠道中以活性形式和有效剂量、优选地以随时间逐渐且持续的方式的释放的适当的制剂。到目前为止，市场上不存在包含PEP的口服制剂，而仅在临床试验中有几个实例，诸如品牌为ALV003的PEPSC和EP-B2(大麦内切蛋白酶)之间的组合(Tye-DinJA,AndersonRP,FfrenchRA,BrownGJ,HodsmanP,SiegelM,BotwickW,ShreeniwasR.TheeffectsofALV003pre-digestionofglutenonimmuneresponseandsymptomsinceliacdiseaseinvivo.ClinImmunol.2010；134:289–95)。然而，似乎到目前为止研究过的口服酶疗法不能够充分降解合计>13g的正常每日麦胶摄入的免疫原性表位，而更确切地说，能够在具有高麦胶敏感性或1型难治性乳糜泄的患者中消除几百毫克至几克麦胶的有害影响，或能够允许偶尔违反无麦胶饮食。最后，目前提出的口服疗法可能要求伴随有意或无意地摄入饮食麦胶的每餐施用PEP。因此，在本领域中对于不受现有技术的缺点影响的用于在乳糜泄的口服治疗中使用的外源PEP的改善的释放存在需求。因此，本专利技术的目的是提供用于外源酶的口服施用的新制剂，所述外源酶选自由脯氨酰内肽酶(PEP)和内切蛋白酶(EP)组成的组，所述新制剂能够在胃肠道中并且以逐步的方式释放以活性形式和有效剂量的酶，以允许PEP和/或EP以每日一次剂量施用。定义和缩写EDA：乙二胺EP：内切蛋白酶HA：透明质酸MA：甲基丙烯酸酐HA-EDA-MA：透明质酸，其中至少一个羟基已经通过与乙二胺(EDA)的反应以及随后的与甲基丙烯酸酐(MA)的反应官能化PEP：脯氨酰内肽酶PEPFM：来源于脑膜炎脓毒性黄杆菌的脯氨酰内肽酶PEPMX：来源于黄色粘球菌的脯氨酰内肽酶PEPSC：来源于Sphingomonascapsulata的脯氨酰内肽酶PEPAN：来源于黑曲霉的脯氨酰内肽酶专利技术概述本专利技术提供包含至少一种外源酶的组合物，所述酶选自由脯氨酰内肽酶(PEP)、内切蛋白酶(EP)及其组合组成的组，所述酶被包埋于光交联的甲基丙烯酸透明质酸衍生物(HA-EDA-MA)水凝胶中，其中透明质酸衍生物包括分子量被包括在50,000和1,500,000道尔顿之间的透明质酸(HA)或其盐，其中至少一个羟基，在用在碳酸苯酯类或卤代甲酸苯酯类之间选择的碳酸化剂活化后，通过与乙二胺(EDA)的反应以及随后的与甲基丙烯酸酐(MA)的反应官能化，优选地通过使用一锅合成法(one-potsynthesis)。所获得的组合物被制备成凝胶或冷冻干燥粉末。令人惊讶地，在冷冻干燥过程期间，包埋于水凝胶中的酶导致被保护免于降解，从而允许本专利技术的组合物的冷冻干燥粉末形式的生产和稳定的保存期。根据本专利技术的组合物允许在模拟胃肠液中以持续的方式且以活性形式释放外源酶，以解毒麦胶蛋白肽。因此，根据本专利技术的组合物适合用于在治疗乳糜泄中使用，并且可以被用于制备常规口服剂型，如颗粒、胶囊或具有或不具有肠溶包衣的片剂，以用于口服施用和以能够使乳糜泄患者中的麦胶蛋白肽解毒的活性形式持续释放酶(PEP、EP或其组合)。因此，本专利技术的主题还是包含根据本专利技术的组合物和至少另一种药学上可接受的成分的药物口服制剂，所述制剂用于在治疗乳糜泄中使用。起始聚合物即透明质酸的粘膜粘附性质可以允许负载有酶(PEP、EP或其组合)的制剂在麦胶蛋白肽必须被解毒的位点粘附至胃肠道的粘膜和因此更长的持续时间。本专利技术的另外的目的是用于制备甲基丙烯酸透明质酸衍生物的方法，其中透明质酸的羟基被乙二胺和随后的甲基丙烯酸酐官能化，所述方法是一锅法。附图简述图1示出HA-EDA-MA衍生物的1H-NMR光谱；图2示出用于HA-EDA-MA溶液的光辐照的Pyrex管-活塞系统的方案；图3示出PEPFM在磷酸盐缓冲溶液pH7.2中的稳定性，表示为在4℃下储存多达5天后用酶处理的底物溶液(Z-Gly-Pro-pNA)在380nm下的吸收度(ABS)的测量；图4示出PEPFM活性，表示为在366nm下辐照持续不同时间后用酶处理的底物溶液(Z-Gly-Pro-pNA)在380nm下的吸收度(ABS)的测量；图5示出在其制备后立刻分析(a)和在4℃下储存10天后分析(b)的从HA-ED本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种组合物，所述组合物包含至少一种外源酶，所述酶选自由脯氨酰内肽酶(PEP)、内切蛋白酶(EP)及其组合组成的组，所述酶被包埋于光交联的甲基丙烯酸透明质酸衍生物(HA‑EDA‑MA)水凝胶中，其中所述透明质酸衍生物包括分子量被包括在50,000和1,500,000道尔顿之间的透明质酸(HA)或其盐，其中至少一个羟基在用在碳酸苯酯类或卤代甲酸苯酯类之间选择的碳酸化剂活化后，通过与乙二胺(EDA)的反应和随后的与甲基丙烯酸酐(MA)的反应官能化。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.05.07 IT FI2014A0001061.一种组合物，所述组合物包含至少一种外源酶，所述酶选自由脯氨酰内肽酶(PEP)、内切蛋白酶(EP)及其组合组成的组，所述酶被包埋于光交联的甲基丙烯酸透明质酸衍生物(HA-EDA-MA)水凝胶中，其中所述透明质酸衍生物包括分子量被包括在50,000和1,500,000道尔顿之间的透明质酸(HA)或其盐，其中至少一个羟基在用在碳酸苯酯类或卤代甲酸苯酯类之间选择的碳酸化剂活化后，通过与乙二胺(EDA)的反应和随后的与甲基丙烯酸酐(MA)的反应官能化。2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述酶以在1mU/mg聚合物和100U/mg聚合物之间的浓度被包埋于所述水凝胶中。3.根据权利要求1-2中任一项所述的组合物，所述组合物呈凝胶的形式。4.根据权利要求1-2中任一项所述的组合物，所述组合物呈冷冻干燥的粉末的形式。5.根据权利要求4所述的组合物，所述组合物还包含相对于聚合物的重量，浓度在0.1％w/w和10％w/w之间的至少一种冷冻保护剂；所述冷冻保护剂优选为海藻糖。6.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中当所述酶是PEP时，所述酶来源于选自由脑膜炎脓毒性黄杆菌(FM)、黄色粘球菌(MX)、Sphingomonascapsulata(Sc)或黑曲霉(AN)或其组合组成的组的微生物，当所述酶是EP时，所述酶是大麦内切蛋白酶。7.根据权利要求1-6中任一项所述的组合物，所述组合物用于在治疗乳糜泄中使用。8.一种用于口服施用的药物制剂，所述制剂包含根据权利要求1-6中任一...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔凡娜·皮塔雷西，法比奥·塞尔瓦托·帕伦博，加埃塔诺·贾莫纳，
申请(专利权)人：内米西斯有限公司，
类型：发明
国别省市：爱尔兰;IE