干涉片段及其应用制造技术

本发明专利技术公开了干涉片段及其应用，其中该干涉片段的作用靶点为如下所示的核苷酸序列：5′-GCCACCATTGTCTTTCCTAGC-3′(SEQ ID NO：10)。该干涉片段针对上述靶点靶向性好，对PD-1的干涉抑制效果突出，并且，将上述干涉片段转入免疫细胞，能够使该免疫细胞PD-1的表达受到长期抑制，得到PD-1表达抑制的免疫细胞，并且该细胞进入人体后获得的增殖细胞PD1的表达也被抑制，进而获得的PD-1表达抑制的免疫细胞能够有效用于制备免疫治疗药物，进而用于肿瘤的免疫治疗，从而能够有效提高免疫治疗效果，降低副作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及免疫生物学
，具体涉及干涉片段及其应用。
技术介绍
恶性肿瘤是人类主要的致死性疾病类型，死亡率居高不下。卫生部最新统计数据表明恶性肿瘤居我国居民前十位死因首位。2010年中国恶性肿瘤发病患者268万人，死亡197万人；目前全国共有恶性肿瘤患者600余万人。每年用于恶性肿瘤病人的医疗费用约占卫生总费用的20％，是全社会最大的医疗负担。目前的治疗手段对于达到治愈、延长恶性肿瘤患者生存期以及改善生活质量等目标的作用仍然十分有限，尤其对于某些类型的恶性肿瘤即使是早期诊断也难以获得满意的疗效，至于转移性、全身性或进展期的恶性肿瘤则更难以治愈。目前的肿瘤治疗策略中，手术和放疗等局部治疗对局限性肿瘤有较好的疗效，而对于全身性、转移性或局部治疗后的微小残留病灶则主要依靠化疗或免疫疗法进行系统性治疗。肿瘤发病是多步骤、多基因作用的结果，肿瘤细胞表现出生长、分化与凋亡的失控。临床上病人症状的多样性和个体遗传异质性，以及肿瘤远处转移病灶的出现，使肿瘤治疗必须以全身性疾病的观点，采用个体化的综合治疗方案。即根据每个肿瘤病人的特点，采用局部治疗结合全身治疗；不仅要消除局部病灶的肿瘤，还要控制肿瘤的复发、转移生长及肿瘤对重要脏器的侵袭，才能真正有效地提高肿瘤病人的治愈率和生存期。通常肿瘤局部病灶的治疗可采取手术和物理治疗(包括射频消融、热疗、放疗、冷冻、超声波及激光治疗等)方法消除，然而对于影像学不能发现的肿瘤微小病灶(如转移复发灶、局部治疗后的残留病灶、血液中的癌细胞)，以上局部治疗手段则无能为力，必须通过全身性治疗手段加以解决。由于肿瘤的转移、复发、扩散更为致命，因此全身性治疗显得尤为重要和紧迫。目前全身性治疗有传统化学治疗、分子靶向药物治疗、生物治疗(包括干细胞移植治疗和免疫细胞治疗)以及基因治疗等。传统化疗虽然在某些肿瘤治疗方面取得了一些进展，但对延长肿瘤病人生存期方面仍然贡献不大。而且肿瘤细胞对化疗药的天然耐药和获得性多药耐药以及化疗毒性，使化学治疗的发展受到了严重的妨碍。多年来的临床实践证明它并非是全身治疗的优势项目。免疫细胞治疗是近二十年发展起来的，由于它治疗范围广(可用于实体肿瘤及白血病)，特别对肿瘤微小病灶(包括转移、复发灶、血液中的癌细胞)更为有效，无毒副作用，而且适用于肿瘤各阶段(如晚期放、化疗不能使用)，因此它是全身治疗的一个优势项目。免疫细胞治疗对提高生命质量、延长生存期有显著的效果，倍受国内外推崇，是目前全身治疗的最佳手段之一，临床潜力巨大。程序性死亡因子1(programmedcelldeath-1,PD-1)是属于共刺激分子28(costimulatorymolecule28,CD28)/细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxiclymphocyteassociatedantigen,CTLA-4)家族的抑制性受体。PD-1不但是程序性死亡细胞的标记，同时表达于B淋巴细胞、T淋巴细胞、NK细胞、NKT细胞以及巨噬细胞表面。近年来研究更是发现，被抗原激活的T淋巴细胞表面会短暂地表达PD-1，而PD-1的持续表达可能会导致T细胞功能紊乱。PD-1表达的广泛性和免疫抑制功能，使其成为近年来免疫治疗的焦点。在癌症、自身免疫病、慢性病毒感染等疾病的治疗中，PD-1均起到了重要的作用。目前，主要PD-1的应用主要表现为开发特异性封闭PD-1信号的抗体，然后将此类抗体药物用于晚期癌症及转移性癌症的治疗，虽然治疗效果尚可，但也经常会有药物相关的不良事件发生。因而，目前PD-1在免疫治疗方面的应用仍有待改进。
技术实现思路
首先，需要说明的是，本专利技术是基于专利技术人的下列发现而完成的：将特异性封闭PD-1信号的抗体药物用于晚期癌症及转移性癌症的治疗，虽然治疗效果尚可，但药物相关的不良事件(adverseevents,AEs)总发生率为41％，3/4级的严重药物AEs为5％，主要包括：皮肤(16％)、胃肠道反应(12％)、肺部(7％)。药物相关的肺炎发生率为(6％)，3级/4级肺炎发生率为2％(2/129)，试验早期有2例患者因肺炎死亡。并且，部分病人对于抗体治疗有应答，也有部分病人在接受抗体治疗后其各项指标无明显变化。有的病人在接受抗体治疗后应答不完全，例如一位72岁多器官癌变的男性病患，在经过一个疗程的治疗后，胰脏的癌变转移性明显降低，但是其他位点癌变无明显变化。有的病人对于抗体治疗应答完全，发生肿瘤退化。此外，有的病例对于此抗体治疗应答情况复杂，例如一位52岁的多处淋巴结核肝脏癌变的女性患者，在接受了抗体治疗后，多处癌变衰退但是有一处淋巴结癌变增强。封闭PD-1信号通路的抗体不是直接作用于肿瘤组织而是通过激活抗肿瘤免疫发挥作用。由于免疫应答的复杂性以及个体差异，这些抗体的治疗效果在不同类型的癌症患者以及不同个体之间差异较大。如前所述，PD-1抑制剂(抗体)经过静脉回输后产生的副作用是存在的，同时系统性免疫疾病的病人不宜用该药，因为PD-1抑制剂可以增强免疫细胞的杀伤能力，增加免疫反应，病情加重。也有部分病人抗体治疗后应答不完全。本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术的一个目的在于提出一种能够有效抑制免疫细胞PD-1表达的手段，由此，通过抑制免疫细胞中PD-1的表达，进而将获得的PD-1表达抑制的免疫细胞用于制备免疫治疗药物，并将该药物用于肿瘤的免疫治疗，从而能够有效解决上述问题，提高PD-1在免疫治疗中的应用范围和应用效果。具体地，为了解决上述问题，本专利技术利用基因工程技术，成功构建了针对PD-1的shRNA的慢病毒载体，并筛选获得了干扰效率超过90％的靶点序列；然后，基于筛选获得的干扰靶点序列，通过携带相应干涉片段的pd-1shRNA慢病毒载体，将筛选的相应干涉片段转入免疫细胞——T淋巴细胞(包括：CTL，TIL，CD8+T，NKT细胞等)，使其PD-1的表达受到长期抑制，得到PD-1表达抑制的免疫细胞，其中该细胞进入人体后获得的增殖细胞PD1的表达也被抑制；进而，专利技术人将该类经过修饰的T细胞回输人体或肿瘤局部，结果发现，能够有效提高免疫治疗效果，最大程度上降低了副作用。因而，根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种干涉片段。根据本专利技术的实施例，该干涉片段的作用靶点为如下所示的核苷酸序列：5′-GCCACCATTGTCTTTCCTAGC-3′(SEQIDNO：10)。专利技术人惊奇地发现，本专利技术的干涉片段针对上述靶点靶向性好，对PD-1的干涉抑制效果突出。并且，根据本专利技术的实施例，将上述干涉片段转入免疫细胞——T淋巴细胞(例如CTL，TIL，CD8+T，NKT细胞等)，能够使该免疫细胞PD-1的表达受到长期抑制，得到PD-1表达抑制的免疫细胞，并且该细胞进入人体后获得的增殖细胞PD1的表达也被抑制，从而，该获得的PD-1表达抑制的免疫细胞能够有效用于制备免疫治疗药物，进而用于肿瘤的免疫治疗，有效提高免疫治疗效果，最大程度上降低了副作用。另外，根据本专利技术上述实施例的干涉片段还可以具有如下附加的技术特征：根据本专利技术的实施例，所述干涉片段由具有下述核苷酸序列的正义链和反义链组成：正义链：5′-GATCCGCCACCATTGTCTTT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种干涉片段，其作用靶点为如下所示的核苷酸序列：5′‑GCCACCATTGTCTTTCCTAGC‑3′(SEQ ID NO：10)。

【技术特征摘要】
1.一种干涉片段，其作用靶点为如下所示的核苷酸序列：5′-GCCACCATTGTCTTTCCTAGC-3′(SEQIDNO：10)。2.根据权利要求1所述的干涉片段，其特征在于，所述干涉片段由具有下述核苷酸序列的正义链和反义链组成：正义链：5′-GATCCGCCACCATTGTCTTTCCTAGCTTCAAGAGAGCTAGGAAAGACAATGGTGGCTTTTTTG-3′(SEQIDNO：11)，反义链：5′-AATTCAAAAAAGCCACCATTGTCTTTCCTAGCTCTCTTGAAGCTAGGAAAGACAATGGTGGCG-3′(SEQIDNO：12)。3.一种抑制免疫细胞中PD-1表达的方法，其特征在于，包括：将权利要求1或2所述的干涉片段转入所述免疫细胞。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，利用慢病毒载体系统将所述干涉片段转入所述免疫细胞。5.根据权利要求3所述的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨光华，
申请(专利权)人：杨光华，
类型：发明
国别省市：上海;31