基于线扫描拉曼显微成像的藻细胞计数及藻种判别方法技术

本发明专利技术公开了一种基于线扫描拉曼显微成像的藻细胞计数及藻种判别方法，包括制备藻细胞检测计数板、藻细胞样本的预处理、藻细胞成像、基于藻细胞拉曼成像的藻细胞计数以及藻种的识别。本发明专利技术提供的一种基于线扫描拉曼显微成像及多元数据挖掘的藻细胞计数及藻种判别分析方法，可实现藻液中细胞的计数及藻种的快速判别分析，易于实现藻细胞的准确计数及藻种的同步快速识别。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于环境监测及保护
，具体涉及一种基于线扫描拉曼显微成像的藻细胞计数及藻种判别方法。
技术介绍
随着经济的迅速发展，到20世纪90年代后期，在我国已调查的湖泊中，有88.6％处于富营养状态。进入21世纪，湖泊富营养化呈现高速发展的态势。目前我国已经发生富营养化的湖泊面积达5000km2，具备发生富营养化条件的湖泊面积达到14000km2。由于富营养化水体面临频繁暴发淡水藻水华的问题，因此，以富营养化水体作为饮用水源，会对我国居民的饮水安全造成严重威胁。在淡水湖泊富营养化引起额水华中，以春夏季微藻水华最为常见，如我国的太湖流域，微藻的生物量占藻类总生物量的90％以上；滇池的微藻水华常年不消退，水质腐败，藻毒素含量居高不下。随着水体污染的加剧，越来越多的湖泊、水库甚至河流也时常暴发水华现象，因此，需要辨别富营养化水体的水华是否由微藻引起以及确定微藻的数量。目前，藻类研究学者可以借助显微镜对藻细胞计数及藻种的识别，但是对于计数的准确度及藻种的识别，在很大程度上受限于试验者在藻细胞形态等方面的经验的积累。随着计算机图像处理技术的发展，开发了一种基于藻细胞成像的细胞计数及识别方法，该方法需要对藻细胞进行光学成像，并采用复杂的图像处理技术对藻细胞进行计数，而对于藻细胞的类型的识别仅基于细胞大小之间的区分。除了传统基于显微镜的藻细胞计数识别方法外，现有技术可用于藻细胞计数的方法还包括基于流式细胞仪、显微成像数字图像处理、光学检测方法及其相互结合的改进方法，这些方法在一定程度上提高了藻细胞的计数精度及识别准确度。但是，这些方法存在着一定的缺陷性，如需要进行复杂的预处理(超声、过滤、染色等)，不能直接计数或识别，同时，采用间接方法需要事先建立标准曲线。因此，寻找一种快速、简单有效的藻细胞计数及藻种判别方法对于本领域技术人员来说是非常有必要的。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种基于线扫描拉曼显微成像及多元数据挖掘的藻细胞计数及藻种判别分析方法，实现藻液中细胞的计数及藻种的同步快速判别分析。为实现上述专利技术目的，本专利技术提供了如下的技术方案：基于线扫描拉曼显微成像的藻细胞计数及藻种判别方法，包括如下步骤：1)制备藻细胞检测计数板：在硅衬底上刻蚀出检测室，所述检测室为1mm*1mm*0.1mm的长方体槽，在检测室底部用线条将所述检测室划分成3*3个小的检测室，在检测室的两个对边再分别刻蚀出样品进口沟道和样品出口沟道；2)藻细胞样本的预处理：将藻液样本用超纯水进行充分稀释至藻细胞不相互重叠，在藻细胞检测计数板上盖上盖玻片，将稀释后的样本从样品进口沟道加至计数板的检测室里，多余的样本则从样品出口通道流出，将藻细胞检测计数板放置在水平的操作台，静置至藻细胞尽可能地吸附在检测室底，不随意游动；3)藻细胞成像：选择532nm激光器，50倍/100倍长焦物镜，基于线扫描的大面积共焦拉曼成像拼接，对藻细胞计数板中的样本进行快速扫描拼接，样品室大面积成像拼接，以藻细胞的特征峰高、峰面积、峰高或峰面积比值和特征峰频移自动成像得到基于线扫描的大面积拼接藻细胞的拉曼成像图；4)基于藻细胞拉曼成像的藻细胞计数：基于线扫描的大面积拼接藻细胞的拉曼成像图，分别对处于检测室四个角成像区域的藻细胞拉曼特征信息进行聚类分析，实现藻细胞分别计数，求出四个区域藻细胞数均值，此均值的9倍即为该检测室中藻细胞的数量，进而实现藻细胞计数，所述藻细胞拉曼特征信息包括特征峰高、峰面积或比值、峰频移；5)藻种的识别：首先，建立不同藻种藻细胞的共焦拉曼光谱标准数据库，包括不同藻种的共焦拉曼光谱、藻种的拉曼特征信息；由已知藻种细胞的共焦拉曼成像图数据库，基于判别式最小二乘算法、支持向量分类机或人工神经网络，建立藻种判别分析模型；基于步骤4)藻细胞计数的结果，将某一聚类样本的特征信息进行平均，作为这一类样本的中心，与藻种细胞数据库进行搜索比对进而对藻种进行识别；或者，以某一聚类中的所有光谱数据为预测集，基于前述建立的藻种判别分析模型，对该聚类藻细胞进行识别。优选的，步骤3)为了使藻细胞成像更清晰，对藻细胞成像图进行滤波和基线校正的预处理，最终获得基于线扫描的大面积拼接藻细胞的拉曼成像图。优选的，步骤3)所述滤波和基线校正的预处理过程可按照两种方法进行，一种方法是以拉曼成像图为基础，采用二维滤波和基线校正算法进行处理；另一种方法是以成像中的单一拉曼光谱为基础，采用一维滤波和基线校正算法进行处理，滤波可为小波滤波、平滑滤波；基线校正可选为小波变换、非对称最小二乘、平滑样条拟合或基于遗传种群基线校正算法。本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供的一种基于线扫描拉曼显微成像及多元数据挖掘的藻细胞计数及藻种判别分析方法，可实现藻液中细胞的计数及藻种的快速判别分析，易于实现藻细胞的准确计数及藻种的同步快速识别。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图：图1表示基于线扫描拉曼显微成像及多元数据挖掘的藻细胞计数及藻种判别分析方案。图2表示藻细胞检测计数板；其中1——石英衬底；2——样品沟道；3——石英盖玻片；4——藻液沉积区域；5——样品沟道；6——扫描激光及散射信号搜集；7——长焦物镜；8——入射激光及散射信号搜集通道。图3表示藻种判别模型的建立及待测藻种的识别。图4表示基于线扫描的蓝绿藻细胞1522cm-1附近特征峰面积拉曼成像示意图。图5表示基于线扫描的蓝绿藻细胞1522cm-1附近特征频移拉曼成像示意图。图6表示蓝绿藻细胞1522cm-1附近特征频移拉曼原始成像效果。图7表示处理后蓝绿藻细胞1522cm-1附近特征频移拉曼成像效果。具体实施方式为了使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术的具体实施进行清楚、完整的描述。显然的，所描述的实施例是本专利技术中的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本专利技术的保护范围。实施例1第一步、采用微加工方法制备藻细胞检测计数板在硅衬底上，采用光刻蚀方法，按照图2所示计数板结构加工藻细胞检测室，检测室边长为1mm*1mm，包括3*3个小的检测室，检测室的深度为0.1mm。即在藻液盛满检测室时，藻液体积为0.1mm3。然后在检测室上覆盖石英盖玻片，以备藻细胞的检测与计数。第二步、样本预处理及实验准备将藻液样本进行一定倍数的稀释，摇匀，采用移液器取一定量的藻液，滴在藻细胞计数板1的进样口2，藻液在虹吸作用下，分散到各个检测室4，多余的藻液用吸水纸从样品沟道5吸出。将藻细胞计数板放置在水平的操作台，静置一段时间，使藻细胞尽可能地吸附在检测室底，不随意游动，方便共焦拉曼进行大面积的扫描拼接，进而可对藻细胞计数及藻种的识别。第三步、藻细胞成像选择532nm激光器，50倍长焦物镜，1％的激光功率，积分时间为2秒。激光透过石英盖玻片聚焦到检测室的藻液样本，基于线扫描的大面积共焦拉曼成像拼接，对藻细胞计数板的样本进行快速扫描。样品室大面积成像拼接，以藻细胞特征峰1522cm-1(归属于类胡萝卜素)为基础自动成像。以蓝绿藻细胞1522cm-1附近特征峰面积拉曼成像为例，如图4所本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于线扫描拉曼显微成像的藻细胞计数及藻种判别方法，其特征在于，包括如下步骤：1)制备藻细胞检测计数板：在硅衬底上刻蚀出检测室，所述检测室为1mm*1mm*0.1mm的长方体槽，在检测室底部用线条将所述检测室划分成3*3个小的检测室，在检测室的两个对边再分别刻蚀出样品进口沟道和样品出口沟道；2)藻细胞样本的预处理：将藻液样本用超纯水进行充分稀释至藻细胞不相互重叠，在藻细胞检测计数板上盖上盖玻片，将稀释后的样本从样品进口沟道加至计数板的检测室里，多余的样本则从样品出口通道流出，将藻细胞检测计数板放置在水平的操作台，静置至藻细胞尽可能地吸附在检测室底，不随意游动；3)藻细胞成像：选择532nm激光器，50倍/100倍长焦物镜，基于线扫描的大面积共焦拉曼成像拼接，对藻细胞计数板中的样本进行快速扫描拼接，其中，样品室大面积成像拼接，以藻细胞的特征峰高、峰面积、峰高或峰面积比值和特征峰频移自动成像得到基于线扫描的大面积拼接藻细胞的拉曼成像图；4)基于藻细胞拉曼成像的藻细胞计数：基于线扫描的大面积拼接藻细胞的拉曼成像图，分别对处于检测室四个角成像区域的藻细胞拉曼特征信息进行聚类分析，实现藻细胞分别计数，求出四个区域藻细胞数均值，此均值的9倍即为该检测室中藻细胞的数量，进而实现藻细胞计数，所述藻细胞拉曼特征信息包括特征峰高、峰面积或比值、峰频移；5)藻种的识别：首先，建立不同藻种藻细胞的共焦拉曼光谱标准数据库，包括不同藻种的共焦拉曼光谱、藻种的拉曼特征信息；由已知藻种细胞的共焦拉曼成像图数据库，基于判别式最小二乘算法、支持向量分类机或人工神经网络，建立藻种判别分析模型；基于步骤4)藻细胞计数的结果，将某一聚类样本的特征信息进行平均，作为这一类样本的中心，与藻种细胞数据库进行搜索比对进而对藻种进行识别；或者，以某一聚类中的所有光谱数据为预测集，基于前述建立的藻种判别分析模型，对该聚类藻细胞进行识别。...

【技术特征摘要】
1.基于线扫描拉曼显微成像的藻细胞计数及藻种判别方法，其特征在于，包括如下步骤：1)制备藻细胞检测计数板：在硅衬底上刻蚀出检测室，所述检测室为1mm*1mm*0.1mm的长方体槽，在检测室底部用线条将所述检测室划分成3*3个小的检测室，在检测室的两个对边再分别刻蚀出样品进口沟道和样品出口沟道；2)藻细胞样本的预处理：将藻液样本用超纯水进行充分稀释至藻细胞不相互重叠，在藻细胞检测计数板上盖上盖玻片，将稀释后的样本从样品进口沟道加至计数板的检测室里，多余的样本则从样品出口通道流出，将藻细胞检测计数板放置在水平的操作台，静置至藻细胞尽可能地吸附在检测室底，不随意游动；3)藻细胞成像：选择532nm激光器，50倍/100倍长焦物镜，基于线扫描的大面积共焦拉曼成像拼接，对藻细胞计数板中的样本进行快速扫描拼接，其中，样品室大面积成像拼接，以藻细胞的特征峰高、峰面积、峰高或峰面积比值和特征峰频移自动成像得到基于线扫描的大面积拼接藻细胞的拉曼成像图；4)基于藻细胞拉曼成像的藻细胞计数：基于线扫描的大面积拼接藻细胞的拉曼成像图，分别对处于检测室四个角成像区域的藻细胞拉曼特征信息进行聚类分析，实现藻细胞分别计数，求出四个区域藻细胞数均值，此均值的9倍即为该检测室中藻细胞的数量，进而实现藻细胞计数，所述藻细胞拉...

【专利技术属性】
技术研发人员：何石轩，谢婉谊，方绍熙，王德强，
申请(专利权)人：中国科学院重庆绿色智能技术研究院，
类型：发明
国别省市：重庆;50