一种高效合成α-氨基丁酸的单细胞工厂及其构建与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种高效合成α‑氨基丁酸的单细胞工厂及其构建与应用，属于微生物技术领域。本发明专利技术将L‑苏氨酸脱氨酶、L‑氨基酸脱氢酶及提供辅因子NADH循环的脱氢酶基因串联表达构建重组的大肠杆菌单细胞工厂用于α‑氨基丁酸高效合成，通过rbs序列优化控制L‑苏氨酸脱氨酶的表达量，解决中间产物酮丁酸的快速积累而抑制转化的问题，同时通过启动子及rbs序列优化控制提供辅因子NADH循环的脱氢酶表达量，增强NADH再生速率最终增加产量。利用单细胞工厂进行全细胞转化可减少物质进出障碍加快转化速率，促进辅因子胞内循环而无需外源添加，成本低廉。在20h内，5L发酵罐中重组大肠杆菌单细胞工厂产量为204g/L，时空产率10.2g/L·h，为其工业化生产提供实际有效策略。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种高效合成α-氨基丁酸的单细胞工厂及其构建与应用，属于微生物

技术介绍
非天然α-氨基酸是区别于能够由生物体自身合成的22种天然α-氨基酸的一大类氨基酸，它们具有重要的生物活性和生理作用，广泛用于多肽、手性药物以及生物碱等化合物的合成。α-氨基丁酸是抑制人体神经信息传递的非天然氨基酸，具有加强葡萄糖磷酸酯酶的活性，促进脑细胞代谢的作用。α-氨基丁酸也是一种重要的化工原料和医药中间体，已广泛用于药物的合成，如抗结核药物盐酸乙胺丁醇和抗癫痫药物左乙拉西坦的合成，市场巨大。α-氨基丁酸的合成方法主要包括化学合成法、酶拆分法及酶转化法三种。其中化学法包括脱硫反应、氨化水解反应、丁酮酸还原法等，化学合成虽然操作简单，但往往反应条件苛刻且易生成副产物，有时需要利用对环境有害的大量有机溶剂，如JefferyE.A.等利用电化学法制备得α-氨基丁酸，产率仅有48％，同时存在副产物谷氨酸。相比之下，微生物法制备α-氨基丁酸具有特异性较强，条件温和，对环境友好等优点。并且随着基因工程技术的发展，构建重组微生物合成非天然氨基酸代谢途径已经可以完成。目前，α-氨基丁酸的微生物法制备主要通过细胞外酶转化法，包括对消旋α-氨基丁酸进行酶法拆分制备及以2-丁酮酸为原料通过脱氢酶或转氨酶来催化制备。在之前的研究中，专利技术人构建了以大宗化学品L-苏氨酸为廉价底物，通过L-苏氨酸脱氨酶、L-氨基酸脱氢酶及辅酶再生系统的酶体系进行一步法制备α-氨基丁酸。以酶转化过程中发现L-苏氨酸脱氨酶的量需要精确控制，不然会造成中间产物酮丁酸的积累，从而抑制了酮丁酸到α-氨基丁酸的转化，造成了酶转化生产α-氨基丁酸的中断。同时，利用酶转化体系去进行α-氨基丁酸的生产需要对产酶的三种重组菌进行细胞破碎，工艺繁琐成本高昂，同时在转化的过程中因酶的失活而影响了转化的稳定性，另外因辅因子的损耗需要不断地外源添加，进一步增加了α-氨基丁酸的生产成本。因此，有必要寻找一种高效稳定但成本低廉的制备α-氨基丁酸的方法。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了利用rbs序列优化控制L-苏氨酸脱氨酶的表达量，同时将其与L-氨基酸脱氢酶及提供辅因子NADH循环的脱氢酶串联到质粒上并在大肠杆菌中的表达，构建成重组大肠杆菌单细胞工厂，利用该单细胞工厂进行全细胞转化高效制备α-氨基丁酸的方法。本专利技术构建了能高效合成α-氨基丁酸的单细胞工厂，主要通过利用rbs优化控制L-苏氨酸脱氨酶(ltd)在重组菌中的表达量，以达到控制中间产物酮酸的积累量，同时利用启动子以及rbs序列进行优化来控制提供辅因子NADH循环的脱氢酶表达量从而控制辅因子NADH的生成速率，最后将不同rbs强度的L-苏氨酸脱氨酶与L-氨基酸脱氢酶基因及经过启动子以及rbs序列优化后的提供辅因子NADH循环的脱氢酶构建在大肠杆菌表达系统中的重组共表达载体，并将其转化到大肠杆菌E.coliBL21中，成功构建了不同的基因工程菌单细胞工厂。在不添加任何外源辅因子的条件下，利用这些单细胞工厂进行全细胞转化法对廉价底物L-苏氨酸进行转化高效制备α-氨基丁酸，为α-氨基丁酸的工业化生产提供了一种实际有效策略。本专利技术的第一个目的是提供一种高效合成α-氨基丁酸的重组菌单细胞工厂，所述重组菌单细胞工厂是将重组共表达载体转化到宿主菌中得到的；所述重组共表达载体是在质粒载体上串联L-苏氨酸脱氨酶基因、L-氨基酸脱氢酶基因、提供辅因子NADH循环的脱氢酶基因；其中，以L-氨基酸脱氢酶基因的表达为基准，控制供辅因子NADH循环的脱氢酶的表达量使辅因子NADH的生成速率处于相对较高的水平，控制L-苏氨酸脱氨酶的表达量处于相对较合适的水平。所述的重组菌单细胞工厂能得到较优的从L-苏氨酸到中间产物酮丁酸及从酮丁酸到α-氨基丁酸的平衡速率，不会造成中间产物酮丁酸的积累因而不会造成对反应的抑制。同时所述的重组菌单细胞工厂不需要外源添加辅因子，相比于其他方法减少了底物进出细胞或扩散的路径从而增加了转化速率。在一种实施方式中，所述控制，是通过但不限于，启动子以及rbs序列优化，也可以是增强子、终止子、沉默子优化等。在一种实施方式中，所述控制是通过启动子和/或rbs序列优化来进行。所述重组菌单细胞工厂的构建方法，包括：(1)根据启动子及L-苏氨酸脱氨酶的基因序列，设计不同强度的rbs序列用来控制L-苏氨酸脱氨酶的表达量从而控制L-苏氨酸到酮丁酸的转化速率；(2)对辅因子NADH的供应速率进行了调控，主要是对启动子以及rbs序列进行优化来控制提供辅因子NADH循环的脱氢酶表达量从而控制辅因子NADH的再生速率；(3)将rbs优化后的L-苏氨酸脱氨酶基因、L-氨基酸脱氢酶基因、启动子以及rbs优化后的提供辅因子NADH循环的脱氢酶基因按顺序连接，构建重组共表达载体，并将重组共表达载体转化宿主菌中，构建基因工程菌单细胞工厂。在一种实施方式中，所述L-苏氨酸脱氨酶基因前有质粒载体自身携带的启动子、针对L-苏氨酸脱氨酶基因和质粒载体设计的表达强度低于质粒载体本身rbs的rbs序列；所述L-苏氨酸脱氨酶基因与L-氨基酸脱氢酶基因之间通过质粒载体自身携带的rbs连接；所述提供辅因子NADH循环的脱氢酶基因前有针对提供辅因子NADH循环的脱氢酶基因和质粒载体设计的启动子、表达强度高于或等于质粒载体本身rbs的rbs序列。在一种实施方式中，所述宿主菌可以是大肠杆菌，也可以是其他宿主，比如枯草芽孢杆菌、棒杆菌、酵母等。在一种实施方式中，所述宿主菌为E.coliBL21。在一种实施方式中，所述质粒载体可以是任意一种可商业化购买的质粒载体，或者是任意一种已有报道的经改造的质粒载体。在一种实施方式中，所述L-苏氨酸脱氨酶选自但不限于大肠杆菌来源的L-苏氨酸脱氨酶(核苷酸序列是NCBI上GeneID:948287)。在一种实施方式中，所述L-氨基酸脱氢酶选自：但不限于，芽孢杆菌来源的L-亮氨酸脱氢酶(NCBI上GeneID:1206507)、芽孢杆菌来源的L-丙氨酸脱氢酶(NCBI上GeneID:936557)、链霉菌来源的L-缬氨酸脱氢酶(NCBI上GeneID:1099526)、红球菌来源的L-苯丙氨酸脱氢酶(NCBI上GeneID:4219741)。在一种实施方式中，所述提供辅因子NADH循环的脱氢酶选自：但不限于博伊丁假丝酵母的甲酸脱氢酶(NCBI上GenBank:KM454879.1)、枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶(NCBI上GeneID:938261)、恶臭假单胞杆菌的葡萄糖脱氢酶(NCBI上GeneID:1045820)。在一种实施方式中，所述rbs序列，可以是不同强度的rbs序列。在一种实施方式中，所述L-苏氨酸脱氨酶基因前的启动子或rbs序列，可以是针对不同表达系统进行优化得到的。在一种实施方式中，所述提供辅因子NADH循环的脱氢酶基因前的启动子或rbs序列，也可以是针对不同表达系统进行优化得到的。在一种实施方式中，所述表达系统包括但不限于大肠杆菌表达系统，也可以是枯草芽孢杆菌表达系统、棒杆菌表达系统、酵母表达体系等。在一种实施方式中，所述宿主为大肠杆菌；所述L-苏氨酸脱氨酶基因前的启动子为T7启动子；L-苏氨酸脱氨酶基因前直接连接本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高效合成α‑氨基丁酸的重组菌单细胞工厂，其特征在于，所述重组菌单细胞工厂是将重组共表达载体转化到宿主菌中得到的；所述重组共表达载体是在质粒载体上串联L‑苏氨酸脱氨酶基因、L‑氨基酸脱氢酶基因、提供辅因子NADH循环的脱氢酶基因；其中，以L‑氨基酸脱氢酶基因的表达为基准，控制供辅因子NADH循环的脱氢酶的表达量使辅因子NADH的生成速率处于相对较高的水平，控制L‑苏氨酸脱氨酶的表达量处于相对较合适的水平。

【技术特征摘要】
1.一种高效合成α-氨基丁酸的重组菌单细胞工厂，其特征在于，所述重组菌单细胞工厂是将重组共表达载体转化到宿主菌中得到的；所述重组共表达载体是在质粒载体上串联L-苏氨酸脱氨酶基因、L-氨基酸脱氢酶基因、提供辅因子NADH循环的脱氢酶基因；其中，以L-氨基酸脱氢酶基因的表达为基准，控制供辅因子NADH循环的脱氢酶的表达量使辅因子NADH的生成速率处于相对较高的水平，控制L-苏氨酸脱氨酶的表达量处于相对较合适的水平。2.根据权利要求1所述的重组菌单细胞工厂，其特征在于，所述的重组菌单细胞工厂能得到较优的从L-苏氨酸到中间产物酮丁酸及从酮丁酸到α-氨基丁酸的平衡速率，不会造成中间产物酮丁酸的积累因而不会造成对反应的抑制；同时所述的重组菌单细胞工厂不需要外源添加辅因子，相比于其他方法减少了底物进出细胞或扩散的路径从而增加了转化速率。3.根据权利要求1所述的重组菌单细胞工厂，其特征在于，所述控制，是通过但不限于，启动子和/或rbs序列优化，也可以是增强子、终止子、沉默子优化等。4.根据权利要求1所述的重组菌单细胞工厂，其特征在于，所述重组菌单细胞工厂的构建方法，包括：(1)根据启动子及L-苏氨酸脱氨酶的基因序列，设计不同强度的rbs序列用来控制L-苏氨酸脱氨酶的表达量从而控制L-苏氨酸到酮丁酸的转化速率；(2)对辅因子NADH的供应速率进行了调控，主要是对启动子以及rbs序列进行优化来控制提供辅因子NADH循环的脱氢酶表达量从而控制辅因子NADH的再生速率；(3)将rbs优化后的L-苏氨酸脱氨酶基因、L-氨基酸脱氢酶基因、启动子以及rbs优化后的提供辅因子NADH循环的脱氢酶基因按顺序连接，构建重组共表达载体，并将重组共表达载体转化宿主菌中，构建基因工程菌单细胞工厂。5.根据权利要求1所述的重组菌单细胞工厂，其特征在于，所述L-苏氨酸脱氨酶基因前有质粒载体自身携带的启动子、针对L-苏氨酸脱氨酶基因和质粒载体设计的表达强度低于质粒载体本身rbs的rbs序列；所述L-苏氨酸脱氨酶基因与L-氨基酸脱氢酶基因之间通过质粒载...

【专利技术属性】
技术研发人员：饶志明，周俊平，杨套伟，张显，徐美娟，张蔡喆，戚云龙，郑俊贤，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32