一种修复多环芳烃污染土壤酶制剂的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种修复多环芳烃污染土壤酶制剂的制备方法，属于酶制剂制备技术领域。本发明专利技术通过培养醋酸钙不动杆菌制得菌丝悬浮液，经化学破碎，透析浓缩得浓缩酶液，经硅藻土负载后干燥，从而得到修复多环芳烃污染土壤酶制剂的制备方法。实例证明，本发明专利技术不仅操作简便，不会引起二次污染，而且利用微生物体内提取出可以降解多环芳烃污染物的胞外酶，用载体对其进行固定，制备出可以直接应用于降解的酶制剂，提高了降解效率，且修复周期短，不易受到环境及土著菌的影响，修复彻底，适合大规模生产应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术公开了一种修复多环芳烃污染土壤酶制剂的制备方法，属于酶制剂制备

技术介绍
酶制剂是指从生物中提取的具有酶特性的一类物质，主要作用是催化食品加工过程中各种化学反应，改进食品加工方法。中国已批准的有木瓜蛋白酶、α—淀粉酶制剂、精制果胶酶、β—葡萄糖酶等6种。酶制剂来源于生物，一般地说较为安全，可按生产需要适量使用。多环芳烃是指两个或两个以上的苯环按一定顺序排列组成的碳氢化合物，如菲、芘、苯并芘等，具有强烈致癌、致畸和致突变特性，土壤中的多环芳烃主要以4～6环多环芳烃为主。由于人类对石化产品的不断开发利用，多环芳烃持续向环境中排放，高温过程形成的多环芳烃大都排放到大气中，随着大气环流、大洋环流等循环而不断扩散，空气、土壤及水体甚至南极及高山冰川等都受到了多环芳烃的污染。多环芳烃和其它固体颗粒物等结合在一起，通过干、湿沉降转入湖泊、海洋，最终主要在沉积物、有机物质和生物体中累积，对人类健康和整个生态系统构成威胁。土壤中的多环芳烃主要来源于大气中多环芳烃干湿沉降、工业污水的排放、输油管道及蓄油设备等的渗漏，一般污染区多环芳烃浓度在103～104μg/kg范围内，但是在重工业区，油田附近等重污染区土壤中多环芳烃的含量就会大大增加，土壤中的多环芳烃通常与其他有机污染物或重金属同时存在引起复合污染，而且，土壤中的多环芳烃还很容易迁移进入地下水，对人类生活造成很大威胁。目前土壤中的多环芳烃的去除过程中，利用化学及物理方法通常会引起二次污染或除去不彻底，如化学氧化或光解多环芳烃时，由于化学能、光能对中间产物的激发作用，会生成毒性更大的中间产物，物理方法通常不能彻底降解多环芳烃，然而另外一种微生物降解就能避免以上弊端。微生物降解是环境中多环芳烃的分解的后主要途径，是目前研究较多也相对成熟的一种技术，而且国内已经有多个现场示范修复多环芳烃污染场地的报道，而且也有较高的修复效率，但是，微生物修复的周期较长，一般以年为周期，在微生物细胞内需要几十种酶的先后催化才能降解为H2O和CO2，而且土壤污染的微生物修复过程中，加入到修复现场环境中的微生物受环境因子、土著菌竞争，而且由于多环芳烃的水不溶性，造成土壤环境中微生物对多环芳烃吸收降解效率较低，微生物修复过程中存在多环芳烃半衰期长的缺点。
技术实现思路
本专利技术主要解决的技术问题：针对目前土壤中多环芳烃在去除的过程中，利用化学及物理方法通常会引起二次污染或者去除不彻底，而微生物降解法虽比较成熟，修复效率高，但其修复周期较长，一般以年为周期，且利用微生物细胞内多种酶催化进行降解时，必须在微生物体内进行，而微生物在待修复土壤中易受环境因子、土著菌竞争，导致吸收降解效率降低的现状，提供了一种通过培养醋酸钙不动杆菌制得菌丝悬浮液，经化学破碎，透析浓缩得浓缩酶液，经硅藻土负载后干燥，从而得到修复多环芳烃污染土壤酶制剂的制备方法。该方法不仅操作简便，不会引起二次污染，而且利用微生物体内提取出可以降解多环芳烃污染物的胞外酶，用载体对其进行固定，制备出可以直接应用于污染物质降解的酶制剂，提高了降解效率，且修复周期短，不易受到环境影响，修复彻底，具有优异的处理性能，适合大规模生产应用。。为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案是：（1）按接种量为8～10%将醋酸钙不动杆菌接种于含200～300mg/kg多环芳烃污染土壤的液体无机盐培养基中，在30～40℃下恒温摇床振荡培养1～2周，将菌种驯化以及活化；（2）再将上述活化后的菌种用接种环转接到含100～150mg/kg多环芳烃污染土壤的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，放入恒温箱，在35～45℃下恒温培养7～9天；（3）待菌种培养结束后，用无菌水缓慢淋洗菌丝表面5～10min，收集淋洗液，得到菌丝悬浮液，放入卧式离心机中，在4～6℃下以6000～8000r/min的转速离心5～10min分离去除上清液，得到湿菌体；（4）称将50～60g上述得到的湿菌体装入500mL烧杯中，向其中加入300～400mL质量浓度为30%盐酸胍溶液，放置在超声振荡仪中，以200～300W功率超声振荡处理2～4h，再以10000～12000r/min的转速离心3～5min分离去除细胞碎片，将上清液转入透析袋，用流动蒸馏水透析浓缩至透析液不再浑浊，得浓缩酶液；（5）将硅藻土和浓缩酶液按固液比为1:5进行混合后放入漩涡振荡仪中，在4～6℃的冰水浴下以30～40W功率旋涡振荡固定7～9h，固定结束后用纱网过滤，分离得到沉淀物，沉淀物经真空冻干机干燥后即得一种修复多环芳烃污染土壤酶制剂。所述的液体无机盐培养基是由1～2g硝酸铵、0.5～1.5g磷酸二氢钾、1.5～2.5g磷酸氢二钠、1～3g氯化钠、0.5～1g蔗糖、20～30g琼脂和100～200mL蒸馏水复配制得。所述的牛肉膏蛋白胨液体培养基是由0.5～1g牛肉膏、1～3g蛋白胨、0.5～1.5g氯化钠、1～3g葡萄糖和100～300mL蒸馏水复配制得。本专利技术的应用方法是：将待修复的土壤全部均匀翻耕后，将本专利技术制得的修复多环芳烃污染土壤酶制剂均匀撒入待修复土壤中，其中每公顷土壤施撒20～30kg，待施撒结束，再将撒过酶制剂的土壤均匀翻耕，即可。不仅操作简便，无二次污染，而且使得污染土壤时修复周期短，不易受到环境及土著菌的影响，修复彻底，适合大规模生产应用。本专利技术的有益效果是：（1）本专利技术操作简便，在制备过程中无任何污染产生，属于绿色环保工艺；（2）本专利技术利用微生物体内提取出可以降解多环芳烃污染物的胞外酶，用载体对其进行固定，制备出可以直接应用于降解的酶制剂，提高了吸收降解效率；（3）本专利技术制得的酶制剂在修复多环芳烃污染土壤时修复周期短，不易受到环境及土著菌的影响，修复极其彻底。具体实施方式首先按接种量为8～10%将醋酸钙不动杆菌接种于含200～300mg/kg多环芳烃污染土壤的液体无机盐培养基中，在30～40℃下恒温摇床振荡培养1～2周，将菌种驯化以及活化；再将上述活化后的菌种用接种环转接到含100～150mg/kg多环芳烃污染土壤的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，放入恒温箱，在35～45℃下恒温培养7～9天；待菌种培养结束后，用无菌水缓慢淋洗菌丝表面5～10min，收集淋洗液，得到菌丝悬浮液，放入卧式离心机中，在4～6℃下以6000～8000r/min的转速离心5～10min分离去除上清液，得到湿菌体；随后称将50～60g上述得到的湿菌体装入500mL烧杯中，向其中加入300～400mL质量浓度为30%盐酸胍溶液，放置在超声振荡仪中，以200～300W功率超声振荡处理2～4h，再以10000～12000r/min的转速离心3～5min分离去除细胞碎片，将上清液转入透析袋，用流动蒸馏水透析浓缩至透析液不再浑浊，得浓缩酶液；最后将硅藻土和浓缩酶液按固液比为1:5进行混合后放入漩涡振荡仪中，在4～6℃的冰水浴下以30～40W功率旋涡振荡固定7～9h，固定结束后用纱网过滤，分离得到沉淀物，沉淀物经真空冻干机干燥后即本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种修复多环芳烃污染土壤酶制剂的制备方法，其特征在于具体制备步骤为：（1）按接种量为8～10%将醋酸钙不动杆菌接种于含200～300mg/kg多环芳烃污染土壤的液体无机盐培养基中，在30～40℃下恒温摇床振荡培养1～2周，将菌种驯化以及活化；（2）再将上述活化后的菌种用接种环转接到含100～150mg/kg多环芳烃污染土壤的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，放入恒温箱，在35～45℃下恒温培养7～9天；（3）待菌种培养结束后，用无菌水缓慢淋洗菌丝表面5～10min，收集淋洗液，得到菌丝悬浮液，放入卧式离心机中，在4～6℃下以6000～8000r/min的转速离心5～10min分离去除上清液，得到湿菌体；（4）称将50～60g上述得到的湿菌体装入500mL烧杯中，向其中加入300～400mL质量浓度为30%盐酸胍溶液，放置在超声振荡仪中，以200～300W功率超声振荡处理2～4h，再以10000～12000r/min的转速离心3～5min分离去除细胞碎片，将上清液转入透析袋，用流动蒸馏水透析浓缩至透析液不再浑浊，得浓缩酶液；（5） 将硅藻土和浓缩酶液按固液比为1:5进行混合后放入漩涡振荡仪中，在4～6℃的冰水浴下以30～40W功率旋涡振荡固定7～9h，固定结束后用纱网过滤，分离得到沉淀物，沉淀物经真空冻干机干燥后即得一种修复多环芳烃污染土壤酶制剂。...

【技术特征摘要】
1.一种修复多环芳烃污染土壤酶制剂的制备方法，其特征在于具体制备步骤为：
（1）按接种量为8～10%将醋酸钙不动杆菌接种于含200～300mg/kg多环芳烃污染土壤的液体无机盐培养基中，在30～40℃下恒温摇床振荡培养1～2周，将菌种驯化以及活化；
（2）再将上述活化后的菌种用接种环转接到含100～150mg/kg多环芳烃污染土壤的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，放入恒温箱，在35～45℃下恒温培养7～9天；
（3）待菌种培养结束后，用无菌水缓慢淋洗菌丝表面5～10min，收集淋洗液，得到菌丝悬浮液，放入卧式离心机中，在4～6℃下以6000～8000r/min的转速离心5～10min分离去除上清液，得到湿菌体；
（4）称将50～60g上述得到的湿菌体装入500mL烧杯中，向其中加入300～400mL质量浓度为30%盐酸胍溶液，放置在超声振荡仪中，以200～300W功率超声振荡处理2～4h，再以10000～12000r/mi...

【专利技术属性】
技术研发人员：周丽花，张帆，林大伟，
申请(专利权)人：常州市鼎日环保科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32