鸟类OASs基因在广谱抗病毒中的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种鸟类OASs基因在影响RNA病毒复制中的应用。鸟类OASs基因可用于抵抗多种类型RNA病毒(如AIV、NDV、IBDV和REO)，为制备转基因动物，为畜、禽的广谱抗病育种提供了一种新手段，应用前景十分广阔。可以通过构建敲除OASs基因的细胞系获得AIV、NDV、IBDV和REO等病毒疫苗生产的工具细胞。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学、基因工程
，具体地，涉及鸟类OASs基因在广谱抗病毒中的应用。
技术介绍
在畜、禽生产中，各种类型疾病(不同类型病毒、同种类型病毒不同亚型)频繁爆发，对畜牧业的生产造成巨大的经济损失，同时给人类的健康带来危害。在RNA类型病毒的复制过程中，由于负责错误修复机制的酶的活性极低，所以其变异很快。RNA病毒变异与演化的主要原因是突变，特别是点突变。目前，很多研究都致力于寻找RNAi，干扰素以及宿主因子等新的方法来实现对不同类型病毒的抵抗作用，因此建立一种广谱抗病的方法也显得尤为重要。先天性免疫是真核生物最古老的抗病防御机制，干扰素作为先天性免疫中最为重要的细胞因子在先天性免疫中发挥重要的作用。因此研究具有干扰素刺激功能的因子成为免疫机制研究中的一个重要方面。2'-5'寡聚腺苷酸合成酶(2'-5'oligoadenylatesynthease，OAS)作为一类干扰素刺激因子，在机体先天性免疫系统中发挥着重要的作用。人OAS家族共包含4个基因，它们分别是OAS1、OAS2、OAS3以及一个OAS样基因OASL。OAS1、OAS2和OAS3分别编码1、2和3个OAS结构域，而OASL除包含一个OAS结构域外，在其C末端还有两个UBL结构域。所以，有必要对禽类OASs基因进行开发利用，从而为畜、禽广谱抗病机制研究及产业化推广提供有效手段。
技术实现思路
本专利技术的目的是开发鸟类OASs基因在广谱抗病毒中的应用。本专利技术的专利技术人在研究中发现水禽包括家鸭是H5N1亚型流感病毒的储存宿主，早期病毒不致死水禽，感染病毒的水禽自身也不表现出明显的临床症状，随着病毒的不断进化，对水禽高致病力的毒株也随之出现。因此专利技术人通过研究比对感染两种亚型H5N1毒株的北京鸭的差异基因表达寻找抗性或易感相关的基因。进而意外的发现鸟类OASs基因能够影响RNA病毒的复制。因此，本专利技术提供了鸟类OASs基因在广谱抗病毒中的应用。可选的，所述OASs基因为鸭OASL基因、鸵鸟OAS1基因和鸵鸟OASL基因中的至少一种。所述鸭OASL基因具有：a)SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；或b)SEQIDNo.1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸所获得的具有同等功能的由SEQIDNO.1衍生的核苷酸序列；所述鸵鸟OAS1基因具有：c)SEQIDNO.7所示的核苷酸序列；或d)SEQIDNo.7所示核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸所获得的具有同等功能的由SEQIDNO.7衍生的核苷酸序列；所述鸵鸟OASL基因具有：e)SEQIDNO.9所示的核苷酸序列；或f)SEQIDNO.9所示核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸所获得的具有同等功能的由SEQIDNO.9衍生的核苷酸序列。其中，所述鸭OASL基因所编码的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。所述鸵鸟OASL基因所编码的氨基酸序列如SEQIDNO.8所示。所述鸵鸟OAS1基因所编码的氨基酸序列如SEQIDNO.10所示。其中，所述病毒为RNA病毒，所述应用包括影响RNA病毒复制。其中，所述RNA病毒可以为单股正链RNA病毒、单股负链RNA病毒、双股RNA病毒以及小RNA病毒。可选的，所述病毒包括AIV病毒、NDV病毒、IBDV病毒和REO病毒。可选的，所述应用包括通过鸟类OASs基因在细胞中的过表达来抑制AIV病毒在细胞中的复制，以及在敲除鸟类OASs基因的细胞中AIV病毒的复制显著增加。可选的，所述应用包括通过鸟类OASs基因在细胞中的过表达来抑制NDV病毒在细胞中的复制，以及在敲除鸟类OASs基因的细胞中NDV病毒的复制显著增加。可选的，所述应用包括通过鸟类OASs基因在细胞中的过表达来抑制IBDV病毒在细胞中的复制，以及在敲除鸟类OASs基因的细胞中IBDV病毒的复制显著增加。可选的，所述应用包括通过鸟类OASs基因在细胞中的过表达来抑制REO病毒在细胞中的复制，以及在敲除鸟类OASs的细胞中REO病毒的复制显著增加。本专利技术还提供了一种用于疫苗生产的工具细胞，其中，所述工具细胞为敲除了鸟类OASs基因的细胞。本专利技术还提供了所述工具细胞的制备方法，该方法包括，构建连接有特异性gRNA片段的PX330载体。其中，所述细胞可以为禽类细胞或哺乳动物细胞；可以为体细胞或者为生殖细胞。所述疫苗为抗RNA病毒疫苗，所述RNA病毒可以为单股正链RNA病毒、单股负链RNA病毒、双股RNA病毒以及小RNA病毒。可选的，所述病毒包括AIV病毒、NDV病毒、IBDV病毒和REO病毒。本专利技术还提供了一种抗病毒转基因动物的构建方法，所述方法包括在动物细胞内转入鸟类OASs基因。可选的，所述方法包括构建含有鸟类OASs基因的载体。可选的，所述载体为导入鸟类OASs基因CDS序列后获得的PiggyBac-AvOASs-C-Flag载体。本专利技术所述鸟类OASs基因可用于制备抗AIV、NDV、IBDV和REO等病毒的转基因动物，此外，敲除鸟类OASs基因的细胞系可以作为AIV、NDV、IBDV和REO等病毒疫苗生产的工具细胞。流感病毒属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的负链RNA病毒，新城疫病毒属于副黏病毒科(Paramyxoviridae)的负链RNA病毒，传染性法氏囊病病毒属于双股RNA病毒科双股RNA病毒属，呼肠孤病毒同样属于双股RNA病毒。本专利技术人发现OASs基因对以上不同类型病毒的复制都具有显著的抑制效果，特提出鸟类OASs基因具有广谱抗病作用(包括不同类型病毒、同种病毒不同亚型)。编码OASL蛋白的基因可用于制备抗多种类型RNA病毒(如AIV、NDV、IBDV和REO)的转基因动物，为畜、禽的广谱抗病育种提供了一种新手段，应用前景十分广阔。此外，本专利技术中所涉及到的敲除OASs基因的细胞系，可以作为AIV、NDV、IBDV和REO等病毒疫苗生产的工具细胞。附图说明图1为本专利技术实施例3中所构建载体PiggyBac-AvOASL-C-Flag的图谱。图2为本专利技术实施例3中PiggyBac-AvOASL-C-Flag载体转染DF1细胞后，对OASL基因的过表达效果的Westernblot验证。图3为本专利技术实施例3中稳定表达OASL蛋白DF1单克隆细胞系的建立。图4为本专利技术实施例3中所用到的CRISPR/Cas9介导的基因打靶载体PX330的图谱。图5为本专利技术实施例3中所本文档来自技高网...

【技术保护点】
鸟类OASs基因在广谱抗病毒中的应用。

【技术特征摘要】
1.鸟类OASs基因在广谱抗病毒中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述OASs基因为
鸭OASL基因、鸵鸟OAS1基因和鸵鸟OASL基因中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述鸭OASL基因
具有：
a)SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；或
b)SEQIDNo.1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或
几个核苷酸所获得的具有同等功能的由SEQIDNO.1衍生的核苷酸序
列；
所述鸵鸟OAS1基因具有：
c)SEQIDNO.7所示的核苷酸序列；或
d)SEQIDNo.7所示核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或
几个核苷酸所获得的具有同等功能的由SEQIDNO.7衍生的核苷酸序
列；
所述鸵鸟OASL基因具有：
e)SEQIDNO.9所示的核苷酸序列；或
f)SEQIDNO.9所示核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或
几个核苷酸所获得的...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄银花，李宁，荣恩光，王小雪，胡加祥，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11