一种海洋石油污染降解用的微生物菌剂制备方法技术

本发明专利技术属于海洋污染降解领域，尤其涉及一种海洋石油污染降解用的微生物菌剂制备方法。本发明专利技术将功能微生物大量发酵培养后，采用微生物菌种三级发酵形式扩培菌液，并采用活化沸石吸附并用PGA包裹，形成菌剂产品，沸石表面包裹保护剂(营养剂)，在沉降过程中尽可能的降低沸石孔径中微生物的损失，同时还能使微生物将包裹剂作为营养源，不对水体造成二次污染，从而达到菌剂有效活菌数＞1亿/g、且投放过程中损失菌数最小的目的。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于海洋污染降解领域，尤其涉及一种海洋石油污染降解用的微生物菌剂制备方法。
技术介绍
海洋石油溢油及石油污染问题一直是影响海洋环境和海洋生态的重要问题。目前对于海洋石油污染，特别是突发性溢油事故的紧急处理，主要针对溢油发生初期的海洋表层海水，采用物理拦截、回收等方式进行应急处置。但是，对于海底溢油或者随水体运动沉降至海底沉积物中的石油污染，目前还没有很好的物理、化学方法可以处理，沉积物中石油降解微生物的环境自净和人为导入石油降解微生物是目前解决海洋沉积物石油污染的主要方式。然而，上述方式存在的缺点在于：1、物理与化学修复法，极易造成二次污染；2、修复大部分只能进行表面漂浮轻质油的围拦与清理；3、修复技术只能短时间作用，不能形成长效性。
技术实现思路
本专利技术针对上述现有技术存在的不足，提供一种海洋石油污染降解用的微生物菌剂制备方法。本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：一种海洋石油污染降解用的微生物菌剂制备方法，包括以下步骤：(1)制备种子液a、制备培养基：在950ml去离子水中加入胰蛋白胨10g、酵母提取物5g和氯化钠10g，摇动容器直至溶质溶解，用5mol/L的NaOH溶液调pH至7.0，再用去离子水定容至1L，在15psi高压下蒸汽灭菌21min；b、在步骤a的培养基中接种海洋修复类菌种，并放置在摇床上培养至吸光度大于1.0，镜检无杂菌制得种子液；(2)制备菌液a、一级发酵：在一级发酵罐中，将胰蛋白胨450g、酵母浸粉120g、氯化钙1.4g、硫酸镁14g、氯化钠800g、硫酸亚铁4g和硫酸氢二钾100g加入到80L水中搅拌溶解后，调节pH至7.5，在121℃、1.5MPa条件下灭菌，降温至30℃，将种子液在无菌条件下接种至一级发酵罐；b、二级发酵：在二级发酵罐中，将胰蛋白胨4800g、酵母浸粉1300g、氯化钙15g、硫酸镁140g、氯化钠8000g、硫酸亚铁40g和硫酸氢二钾1000g加入到800L水中搅拌溶解后，调节pH至7.5，在121℃、1.5MPa条件下灭菌，降温至30℃；当一级发酵罐中的的菌液吸光度大于1.0时，将发酵液在无菌条件下转移至二级发酵罐中，无菌过滤通风搅拌培养，多点无菌取样，监测至吸光度大于1.1，杂菌率控制在10wt％以下，完成二级发酵；c、三级发酵：在三级发酵罐中，将胰蛋白胨25kg、酵母浸粉7kg、氯化钙80g、硫酸镁750g、氯化钠40kg、硫酸亚铁210g和硫酸氢二钾5kg加入到4000L水中搅拌溶解后，调节pH至7.5，在121℃、1.5MPa条件下灭菌，降温至30℃，将二级发酵罐中的发酵液转移至三级发酵罐，无菌过滤通风搅拌培养，多点无菌取样，监测至吸光度大于1.2，杂菌率控制在20wt％以下，完成三级发酵；d、保存：将完成三级发酵的发酵菌液在4℃条件下冷藏储存在菌液上料罐中；(3)吸附：将菌液上料罐中的菌液与沸石上料罐中的沸石按照重量比2:1加入搅拌罐Ⅰ中，进行旋转搅拌，混合吸附20min；(4)控液：将步骤(3)吸附菌剂后的沸石输送到脱水筛上，通过振动将液体滤除，控液6min；(5)包裹：将步骤(4)混合控液脱水后的产品与聚谷氨酸溶液罐中浓度7wt％的聚谷氨酸溶液同时加入搅拌罐Ⅱ中进行搅拌、混合、包裹10min；(6)保存：将步骤(5)包裹后的菌剂装入吨袋中保存。其中，步骤(1)中所述的海洋修复类菌种为芽孢杆菌或海单胞菌。步骤(6)吨袋中的菌剂重量为1±0.1吨，有效活菌数≥1亿/克。本专利技术的有益效果是：本专利技术将功能微生物大量发酵培养后，采用微生物菌种三级发酵形式扩培菌液，并采用活化沸石吸附并用PGA包裹，形成菌剂产品，沸石表面包裹保护剂(营养剂)，在沉降过程中尽可能的降低沸石孔径中微生物的损失，同时还能使微生物将包裹剂作为营养源，不对水体造成二次污染，从而达到菌剂有效活菌数＞1亿/g、且投放过程中损失菌数最小的目的。附图说明图1为本专利技术的工艺流程图；图中，1、沸石上料罐；2、菌液上料罐；3、搅拌罐Ⅰ；4、脱水筛；5、搅拌罐Ⅱ；6、聚谷氨酸溶液罐。具体实施方式以下结合实例对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。实施例1一种海洋石油污染降解用的微生物菌剂制备方法，包括以下步骤：(1)制备种子液a、制备培养基：在950ml去离子水中加入胰蛋白胨10g、酵母提取物5g和氯化钠10g，摇动容器直至溶质溶解，用5mol/L的NaOH溶液调pH至7.0，再用去离子水定容至1L，在15psi高压下蒸汽灭菌21min；b、在步骤a的培养基中接种海洋修复类菌种，并放置在摇床上培养至吸光度大于1.0，镜检无杂菌制得种子液；(2)制备菌液a、一级发酵：在一级发酵罐中，将胰蛋白胨450g、酵母浸粉120g、氯化钙1.4g、硫酸镁14g、氯化钠800g、硫酸亚铁4g和硫酸氢二钾100g加入到80L水中搅拌溶解后，调节pH至7.5，在121℃、1.5MPa条件下灭菌，降温至30℃，将种子液在无菌条件下接种至一级发酵罐；b、二级发酵：在二级发酵罐中，将胰蛋白胨4800g、酵母浸粉1300g、氯化钙15g、硫酸镁140g、氯化钠8000g、硫酸亚铁40g和硫酸氢二钾1000g加入到800L水中搅拌溶解后，调节pH至7.5，在121℃、1.5MPa条件下灭菌，降温至30℃；当一级发酵罐中的的菌液吸光度大于1.0时，将发酵液在无菌条件下转移至二级发酵罐中，无菌过滤通风搅拌培养，多点无菌取样，监测至吸光度大于1.1，杂菌率控制在10wt％以下，完成二级发酵；c、三级发酵：在三级发酵罐中，将胰蛋白胨25kg、酵母浸粉7kg、氯化钙80g、硫酸镁750g、氯化钠40kg、硫酸亚铁210g和硫酸氢二钾5kg加入到4000L水中搅拌溶解后，调节pH至7.5，在121℃、1.5MPa条件下灭菌，降温至30℃，将二级发酵罐中的发酵液转移至三级发酵罐，无菌过滤通风搅拌培养，多点无菌取样，监测至吸光度大于1.2，杂菌率控制在20wt％以下，完成三级发酵；d、保存：将完成三级发酵的发酵菌液在4℃条件下冷藏储存在菌液上料罐中；(3)吸附：将菌液上料罐中的菌液与沸石上料罐中的沸石按照重量比2:1加入搅拌罐Ⅰ中，进行旋转搅拌，混合吸附20min；(4)控液：将步骤(3)吸附菌剂后的沸石输送到脱水筛上，通过振动将液体滤除，控液6min；(5)包裹：将步骤(4)混合控液脱水后的产品与聚谷氨酸溶液罐中浓度7wt％的聚谷氨酸溶液同时加入搅拌罐Ⅱ中进行搅拌、混合、包裹10min；(6)保存：将步骤(5)包裹后的菌剂装入吨袋中保存。经检测，每吨袋中的菌剂重量为1±0.1吨，有效活菌数≥1亿/克。以上所述仅为本专利技术的较佳实施例，并不用以限制本专利技术，凡在本专利技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本专利技术的保护范围之内。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种海洋石油污染降解用的微生物菌剂制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备种子液a、制备培养基：在950ml去离子水中加入胰蛋白胨10g、酵母提取物5g和氯化钠10g，摇动容器直至溶质溶解，用5mol/L的NaOH溶液调pH至7.0，再用去离子水定容至1L，在15psi高压下蒸汽灭菌21min；b、在步骤a的培养基中接种海洋修复类菌种，并放置在摇床上培养至吸光度大于1.0，镜检无杂菌制得种子液；(2)制备菌液a、一级发酵：在一级发酵罐中，将胰蛋白胨450g、酵母浸粉120g、氯化钙1.4g、硫酸镁14g、氯化钠800g、硫酸亚铁4g和硫酸氢二钾100g加入到80L水中搅拌溶解后，调节pH至7.5，在121℃、1.5MPa条件下灭菌，降温至30℃，将种子液在无菌条件下接种至一级发酵罐；b、二级发酵：在二级发酵罐中，将胰蛋白胨4800g、酵母浸粉1300g、氯化钙15g、硫酸镁140g、氯化钠8000g、硫酸亚铁40g和硫酸氢二钾1000g加入到800L水中搅拌溶解后，调节pH至7.5，在121℃、1.5MPa条件下灭菌，降温至30℃；当一级发酵罐中的的菌液吸光度大于1.0时，将发酵液在无菌条件下转移至二级发酵罐中，无菌过滤通风搅拌培养，多点无菌取样，监测至吸光度大于1.1，杂菌率控制在10wt％以下，完成二级发酵；c、三级发酵：在三级发酵罐中，将胰蛋白胨25kg、酵母浸粉7kg、氯化钙80g、硫酸镁750g、氯化钠40kg、硫酸亚铁210g和硫酸氢二钾5kg加入到4000L水中搅拌溶解后，调节pH至7.5，在121℃、1.5MPa条件下灭菌，降温至30℃，将二级发酵罐中的发酵液转移至三级发酵罐，无菌过滤通风搅拌培养，多点无菌取样，监测至吸光度大于1.2，杂菌率控制在20wt％以下，完成三级发酵；d、保存：将完成三级发酵的发酵菌液在4℃条件下冷藏储存在菌液上料罐中；(3)吸附：将菌液上料罐中的菌液与沸石上料罐中的沸石按照重量比2:1加入搅拌罐Ⅰ中，进行旋转搅拌，混合吸附20min；(4)控液：将步骤(3)吸附菌剂后的沸石输送到脱水筛上，通过振动将液体滤除，控液6min；(5)包裹：将步骤(4)混合控液脱水后的产品与聚谷氨酸溶液罐中浓度7wt％的聚谷氨酸溶液同时加入搅拌罐Ⅱ中进行搅拌、混合、包裹10min；(6)保存：将步骤(5)包裹后的菌剂装入吨袋中保存。...

【技术特征摘要】
1.一种海洋石油污染降解用的微生物菌剂制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备种子液a、制备培养基：在950ml去离子水中加入胰蛋白胨10g、酵母提取物5g和氯化钠10g，摇动容器直至溶质溶解，用5mol/L的NaOH溶液调pH至7.0，再用去离子水定容至1L，在15psi高压下蒸汽灭菌21min；b、在步骤a的培养基中接种海洋修复类菌种，并放置在摇床上培养至吸光度大于1.0，镜检无杂菌制得种子液；(2)制备菌液a、一级发酵：在一级发酵罐中，将胰蛋白胨450g、酵母浸粉120g、氯化钙1.4g、硫酸镁14g、氯化钠800g、硫酸亚铁4g和硫酸氢二钾100g加入到80L水中搅拌溶解后，调节pH至7.5，在121℃、1.5MPa条件下灭菌，降温至30℃，将种子液在无菌条件下接种至一级发酵罐；b、二级发酵：在二级发酵罐中，将胰蛋白胨4800g、酵母浸粉1300g、氯化钙15g、硫酸镁140g、氯化钠8000g、硫酸亚铁40g和硫酸氢二钾1000g加入到800L水中搅拌溶解后，调节pH至7.5，在121℃、1.5MPa条件下灭菌，降温至30℃；当一级发酵罐中的的菌液吸光度大于1.0时，将发酵液在无菌条件下转移至二级发酵罐中，无菌过滤通风搅拌培养，多点无菌取样，监测至吸光度大于1.1，杂菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：温国义，刘慧，刘铭平，张晓东，赵君才，
申请(专利权)人：烟台大境生态环境科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37