一种血小板涂片免疫组织化学染色的观察方法技术

本发明专利技术公开了一种通过在现有技术上改进的一种血小板涂片免疫组织化学染色的观察方法，涉及生物医学技术领域，具体地说是一种血小板涂片免疫组织化学染色的观察方法。其特征是：该方法的制作步骤，离心、分离富含血小板的血浆0.5ml，涂片；涂片自然干燥；乙醇固定；免疫组织化学染色涂片。显微镜下观察血小板的显微结构，血小板活性物质表达所致色泽改变情况，拍摄多个视野照片，进行分析。本发明专利技术提供一种血小板涂片免疫组织化学染色的观察方法，显微镜下观察血小板的显微形态明瞭，色泽变化反映出血小板活性物质的表达，提供了一种新的血小板显微结构图像与功能改变的观察方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种生物医学
，具体地说是一种血小板涂片免疫组织化学染色的观察方法。
技术介绍
血小板(blood platelet)是人血液中三种有形成分(红细胞、白细胞、血小板)之一，血小板是骨髓中巨核细胞质脱落下来的小块，表面有完整的细胞膜，无细胞核，血小板体积小，直经为2微米～4微米。血小板在生理性止血、维持血管壁完整性以及某些病理过程，如血栓形成、动脉粥样硬化、不稳定性心绞痛、肿瘤转移和炎症反应等过程中起着重要作用。因此，血小板功能检测对早期发现是否有血栓形成的危险以及血小板相关疾病的诊断和治疗有着重要的意义。血小板的功能检测可分为血小板一般功能测定，血小板黏附、聚集及释放功能的测定和流式细胞术分析等。血小板一般功能测定包括：血小板计数、出血时间的测定、血块收缩试验、活化凝血时间测定、快速血小板功能分析法等，只能作为临床评价血小板功能的辅助手段。血小板黏附、聚集参与止血和血栓形成过程，是血小板的一个重要生理特性，有多种实验方法，体外血小板聚集实验还不能准确反应体内血小板的聚集功能和血小板活化水平的变化。目前以血小板释放功能的检测来反映血小板活化水平的变化，常用商品化的放射免疫法和酶联免疫吸附法试剂盒检测血小板释放功能，血小板胞浆内含有a颗粒、致密颗粒及溶酶体颗粒，当加入诱聚剂后会引起这些颗粒内容物的释放，即血小板的释放。a颗粒的释放主要通过β-血小板球蛋白(β-TG)和血小板4因子(PF4)来测定，其结果对样品的处理过程高度敏感，但是结果易受机体代谢功能和血小板破坏的影响。流式细胞术检测血小板释放功能有很大的优势，敏感性较高。传统流式细胞术在血小板功能检测中应用，样本在离心、洗涤等操作过程中极易活化，导致血小板体外激活，影响临床诊断价值。全血法流式细胞术直接应用全血，反映了血小板生理状态下的功能，同时简化了标本的处理，最大限度地减少了人为活化血小板。但是，流式细胞仪价格昂贵，仪器操作复杂；同时为了避免血小板体外活化，血样本需在45分钟内处理，不能长久放置，只能分析循环中的血小板的数量和功能，不能反映血小板代谢和最近被清除的血小板的数量。目前，缺乏血小板显微形态变化与功能变化需要同时观察的有效检测方法。血小板可能参与多种疾病的发病机制，现有血小板功检测技术未能很好解决同时观察血小板显微形态与功能变化，本专利技术重新组合检测工艺流程，解决了上述血小板显微形态变化与功能变化需要同时观察这个难题。本专利技术所要解决的技术问题是不同于现有血小板释放功能检测的方法，提供一种从血液样本中有效分离血小板，制作血小板涂片，以免疫组织化学染色血小板进行观察的改良技术方法。显微镜下观察血小板的显微形态明瞭，色泽变化反映出血小板活性物质的表达，为实验室补充了一种血小板显微结构图像与功能改变能同时观察的新方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种从血液样本中有效分离血小板，制作一种血小板涂片免疫组织化学染色观察的方法，保证血小板显微形态与活性改变的观察方法有效性。本专利技术采用的技术方案是，一种血小板涂片免疫组织化学染色的观察方法，其特征在于，所述制作步骤：硅化处理试管、吸管；采静脉血2ml注入抗凝试管；在4℃低温下，标本经1000r/min离心10min，分离富含血小板的血浆；移液枪取富含血小板的血浆50μl，移至蛋白膜载玻片上；以推玻片推制血小板涂片约2cm×3cm大小，自然干燥或电吹风冷风吹干；将自然干燥的血小板涂片浸入无水乙醇液中，固定15分钟；涂片拿出，沥干，放入标本盒，包封冷藏。根据需要测定的血小板活性物质而选择人血小板相关抗体的免疫组化试剂盒；把血小板涂片用蜡笔分区定格，3％去离子水孵育5～15分钟，以消除内源性过氧化物酶活性；蒸馏水冲洗，磷酸缓冲盐溶液浸泡5分钟；滴加免疫组织化学试剂A，室温孵育10～15分钟，倾去；滴加适当比例的免疫组化试剂一抗，37℃孵育2～3小时或者4℃冰箱过夜；磷酸缓冲盐溶液冲洗3分钟×3次；滴加生物素化二抗工作液，即试剂B，室温或37℃孵育10～15分钟，磷酸缓冲盐溶液冲洗3分钟×3次；滴加辣根过氧化物酶标志的链酶卵白素工作液，即试剂C，室温或37℃孵育10～15分钟，磷酸缓冲盐溶液冲洗3分钟×3次；显色剂显色3～5分钟，自来水冲洗；苏木素复染几秒，自来水冲洗，待干；200倍油性显微镜下观察血小板的显微形态，血小板活性物质表达所致色泽改变情况。以显微镜配备的数码相机，变换多个视野，拍摄照片分析；用(-)(+)来表示，以四分法判断免疫组织化学的结果，即阳性细胞数≤25％为(+)，25％～50％为(++)，＞50％为(+++)，无阳性细胞(-)；再结合染色强度，着色浅黄色为(+)，着色棕黄色(++)，着色棕褐色为(+++)，无着色细胞为(-)。以阳性细胞数与免疫组化染色强度两者合二为一进行分析判断。以3个25％判断染色阳性细胞，取阳性细胞大于50％，即一半以上研究细胞阳性判断为最高级(+++)。进一步地说，所述制作步骤：1.富含血小板的血浆与血小板涂片制作(1)硅化处理试管、吸管；采静脉血2ml注入抗凝试管；(2)在4℃低温下，标本经1000r/min离心10min，分离富含血小板的血浆；(3)移液枪取富含血小板的血浆50μl，移至蛋白膜载玻片上；以推玻片推制血小板涂片约2cm×3cm大小，自然干燥或电吹风冷风吹干；(4)将自然干燥的血小板涂片浸入无水乙醇液中，固定15分钟；涂片拿出，沥干，放入标本盒，包封冷藏。2.血小板涂片的免疫组织化学染色(1)根据需要测定的血小板活性物质而选择人血小板相关抗体的免疫组化试剂盒；(2)把血小板涂片用蜡笔分区定格，3％去离子水孵育5～15分钟，以消除内源性过氧化物酶活性；(3)蒸馏水冲洗，磷酸缓冲盐溶液浸泡5分钟；滴加免疫组织化学试剂A，室温孵育10～15分钟，倾去；滴加适当比例的免疫组化试剂一抗，37℃孵育2～3小时或者4℃冰箱过夜；(4)磷酸缓冲盐溶液冲洗3分钟×3次；滴加生物素化二抗工作液，即试剂B，室温或37℃孵育10～15分钟，磷酸缓冲盐溶液冲洗3分钟×3次；滴加辣根过氧化物酶标志的链酶卵白素工作液，即试剂C，室温或37℃孵育10～15分钟，磷酸缓冲盐溶液冲洗3分钟×3次；(5)显色剂显色3～5分钟，自来水冲洗；苏木素复染几秒，自来水冲洗，待干。3.血小板免疫组织化学染色涂片的显微镜观察(1)200倍油性显微镜下观察血小板的显微形态，血小板活性物质表达所致色泽改变情况。以显微镜配备的数码相机，变换多个视野，拍摄照片分析；(2)用(-)(+)来表示，以四分法判断免疫组织化学的结果，即阳性细胞数≤25％为(+)，25％～50％为(++)，＞50％为(+++)，无阳性细胞(-)；再结合染色强度，着色浅黄色为(+)，着色棕黄色(++)，着色棕褐色为(+++)，无着色细胞为(-)。以阳性细胞数与免疫组化染色强度两者合二为一进行分析判断。以3个25％判断染色阳性细胞，取阳性细胞大于50％，即一半以上研究细胞阳性判断为最高级(+++)。附图说明图1为本实施例血小板涂片免疫组织化学染色所显示活化的血小板放大200倍的显微镜照片，可见血小板显微形态变化，血小板体积增大，聚集成团，胞体边缘有突起，着色深为棕褐色。图2为本实施例无明显活化状态的血小板本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种血小板涂片免疫组织化学染色的观察方法，其特征在于，所述该方法的制作步骤，离心、分离富含血小板的血浆0.5ml，涂片；涂片自然干燥；乙醇固定；免疫组织化学染色涂片。

【技术特征摘要】
1.一种血小板涂片免疫组织化学染色的观察方法，其特征在于，所述该方法的制作步骤，离心、分离富含血小板的血浆0.5ml，涂片；涂片自然干燥；乙醇固定；免疫组织化学染色涂片。2.按照...

【专利技术属性】
技术研发人员：诸葛毅，俎德玲，王小同，
申请(专利权)人：衢州职业技术学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33