一种高产藻蓝蛋白的红藻培养方法技术

本发明专利技术涉及一种高效的红藻培养方法，所述方法包括红藻的异养或混养培养和光自养培养，光自养培养是以异养或混养培养所获得的藻细胞作为种子来实施。本发明专利技术还涉及一种快速积累藻蓝蛋白的方法。采用本发明专利技术的方法可充分发挥红藻在异养或混养阶段藻细胞快速生长的优势，为后续光自养阶段提供大量藻种。红藻在光自养阶段快速生长，并且积累藻蓝蛋白。本申请提供的方法可以解决现有红藻光自养培养过程中细胞生长速率过慢和利用微藻生产藻蓝蛋白时存在的含量及产率低的问题。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种高效的红藻培养方法，所述方法包括红藻的异养或混养培养和光自养培养，光自养培养是以异养或混养培养所获得的藻细胞作为种子来实施。本专利技术还涉及一种快速积累藻蓝蛋白的方法。
技术介绍
红藻属红藻门(Rhodophyta)，藻体含有叶绿素a、叶绿素b、叶黄素和胡萝卜素，以及大量的藻红蛋白和藻蓝蛋白，常因各类色素的含量不同，使藻体出现鲜红或粉红、紫、紫红等不同的颜色。有些单细胞红藻(unicellular rhodophyte)在生长过程中可积累大量的特殊色素——藻蓝蛋白(Graverholt O和Eriksen N.,Heterotrophic high-cell-density fed-batch and continuous-flow cultures of Galdieria sulphuraria and production of phycocyanin.Applied Microbiology&Biotechnology,77(1):69-75,2007)。藻蓝蛋白(phycocyanin)是天然存在的色素蛋白，主要存在于红藻、蓝藻和隐藻中。分离出的蓝藻蛋白呈深蓝色粉末状。蓝藻蛋白具有良好的保健功能，例如可以抗癌、抗氧化、促进血细胞再生等。藻蓝蛋白又是一种良好的天然食用色素，可以广泛用作多种食品的添加剂。又由于藻蓝蛋白中含有荧光，所以可以用作实验中的荧光剂。因此，蓝藻蛋白具有极高应用价值。目前国内外藻蓝蛋白的生产提取主要源于螺旋藻，光自养培养的螺旋藻中藻蓝蛋白含量可达12％(张义明，《螺旋藻混合营养生长与藻蓝蛋白含量》，贵州工业大学学报:自然科学版,(3):64-69,1997)，但光自养培养螺旋藻生产藻蓝蛋白的弊端在于光自养培养的生物量低和藻蓝蛋白的产率低，远远不能满足大规模生产和市场的需求。近年来，利用红藻产藻蓝蛋白的研究逐渐深入，据文献报道，红藻可以大量利用有机碳源进行异养生长，异养培养红藻的藻蓝蛋白产率可达0.5-0.9g/L/d，是螺旋藻(Spirulina platensis)的20-278倍(Graziani G,Schiavo S,Nicolai MA等，Microalgae as human food:chemical and nutritional characteristics of the thermo-acidophilic microalga Galdieria sulphuraria.Food&function,4(1):144-152,2013)，且与螺旋藻的C型藻蓝蛋白不同，红藻的藻蓝蛋白为R型，具有更强的热稳定性，在抑制癌细胞和抗食物过敏有着更强的功效。此外，红藻也可以在光自养条件下积累藻蓝蛋白，光自养培养的红藻的藻蓝蛋白含量可达10％(Graziani G,Schiavo S,Nicolai MA等，Microalgae as human food:chemical and nutritional characteristics of the thermo-acidophilic microalga Galdieria sulphuraria.Food&function,4(1):144-152,2013)，而使用本专利技术方法的实施例中达到14.50％。因此，利用红藻生产提取藻蓝蛋白具有广阔的应用前景。温泉红藻(Cyanidiophyceae，简称Cyanidia)是一群生活在高温高酸的极端环境中的单细胞红藻，能够通过光合作用将太阳的能量转化成糖类。温泉红藻主要分布在世界各地的火山活动仍然活跃、并具有硫酸成分高的温泉水体的地区，如美国黄石国家公园、意大利火山区、新西兰火山区、印尼火山区及日本火山区等。目前国内外对于温泉红藻的研究主要集中在异养培养方面。虽然红藻的异养培养过程可以实现生物量的快速增长，但获得的藻细胞内藻蓝蛋白的含量较低，因此也无法用于以高产藻蓝蛋白为目的红藻规模化培养。此外，异养过程，通常选择的培养基为普通的微藻异养培养基，未添加促进藻蓝蛋白积累的植物生长激素类物质，培养过程通常不加以调控或通过间歇流加未经优化的补料培养基，这一方法未考虑红藻异养与普通光自养在营养需求上存在的差异，造成培养基对藻蓝蛋白的积累效果不佳，藻蓝蛋白产率低下。另一方面，光自养可以获得较高藻蓝蛋白含量的藻细胞，目前光自养培养红藻所用藻种均采用光自养培养获得；同时，在细胞内积累藻蓝蛋白是一个极其耗能的过程，效率较低，这也就意味着红藻的光自养生长速率和产率要比其他微藻低，倍增时间要比其他微藻长。虽然红藻的光自养培养过程可积累大量的藻蓝蛋白，但大规模生产时需要及时提供大量高活力的细胞作为光自养培养时的种子。综上，本领域亟需一种高效的红藻培养工艺和方法。同时，本领域也亟需一种高效的藻蓝蛋白生产方法。专利技术简述针对上述问题，本申请提供了一种有效的解决方法。本专利技术涉及一种高效的红藻培养方法，所述方法包括红藻的异养培养、混养培养(又称兼养培养方式)和光自养培养，光自养培养是以异养或混养培养所获得的藻细胞作为种子来实施。本专利技术还涉及一种快速积累藻蓝蛋白的方法。采用本申请提供的方法可充分发挥红藻在异养或混养阶段藻细胞快速生长的优势，为红藻在光自养培养时提供大量的藻种，以及微藻在光自养阶段快速生长并积累细胞中的活性物质(例如藻蓝蛋白)。本申请提供的方法可以获得高的细胞产率和代谢物质产率，为解决红藻光自养培养过程中细胞生长速率过慢和活性物质(例如藻蓝蛋白)含量低、产率低的问题提供重要的技术手段。具体而言，本专利技术具备如下优点：(1)本申请提供的方法可以大大提高藻种培养速率。以一般户外大池培养微藻的初始接种密度为0.05～0.1g/l、大池的体积一般为5000L为例，如果需满足这一要求，则需要250～500g的微藻。如果采用现有技术中传统的光自养扩培藻种的方法，红藻种光自养扩培10天的藻细胞密度为0.5g/l，培养体积为500L，那么如果要达到上述的微藻产量，则需要1～2月的时间；而采用本申请提供的异养培养藻种的方法，则只需数天即可完成。(2)与传统的藻种光自养培养相比，本申请提供的方法可以减少藻种培养过程中的装置及设备数量，并且占地面积小，单位培养面积产率高。以(1)中所述的例子，如果采用现有技术中传统的藻种光自养扩培，需要500L的培养装置，并且占用时间较长，一般1～2个月。而采用本申请提供的藻种进行异养培养，则只需50L的培养装置，并且占用时间较短，一般10～20天。(3)与传统的藻种光自养培养相比，本申请提供的藻种异养或混养培养方法不受户外天气及环境的影响。使用现有技术中传统的藻种光自养培养时，若遇到短期的阴雨天气而无法继续培养时，则需要搬入室内并添加人工光来继续进行光自养培养藻种，因此增加了藻种异养培养时所不需要的人工光照费用。另外，户外光自养的藻种若受到原生动物、浮游生物等污染，那么本批藻种则会报废，需重新再进行藻种的扩培工作，还会导致下一步光自养培养没有藻种用于培养的问题，严重影响生产。(4)当使用本申请提供的藻种异养或混养培养方法进行户外大池培养时，接种量越大，越不容易受到其他杂藻或原生动物等污染。因此，藻种的异养或混养培养本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种红藻培养方法，其特征在于，所述方法包括红藻的异养或混养培养，以及光自养培养，其中所述异养或混养培养包括：在生物反应器中加入培养基，接入微藻藻种进行培养，优选所述接入微藻藻种是按工作体积的0.1～20％接入。

【技术特征摘要】
2016.04.18 CN 20161024667911.一种红藻培养方法，其特征在于，所述方法包括红藻的异养或混养培养，以及光自养培养，其中所述异养或混养培养包括：在生物反应器中加入培养基，接入微藻藻种进行培养，优选所述接入微藻藻种是按工作体积的0.1～20％接入。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述异养或混养培养的培养基含有氮源、有机碳源、无机盐、微量元素和水，优选所述异养和混养培养的培养基还含有植物生长激素。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述有机碳源包括葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、淀粉、乙酸、乙酸钠、纤维素半纤维素的水解物、甘油，优选葡萄糖；优选所述植物生长激素包括2,4-二氯苯氧乙酸、苄氨基嘌呤、脱落酸、赤霉素、3-吲哚丁酸、萘乙酸和芸苔素中的一种或多种，优选所述植物生长激素的浓度是0.001-35毫克/升培养基，优选0.001-20毫克/升，更优选0.001-15毫克/升，0.005-10毫克/升，0.01-10毫克/升，0.1-5毫克/升；优选所述微量元素宜选自H3BO3、ZnSO4·7H2O、MnCl2·H2O、(NH4)6Mo7O24·4H2O、CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O、NaVO3·4H2O中的一种或多种。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述异养或混养培养基基本上由以下成分组成：(NH4)2SO4 0.1～5克/升、葡萄糖0.1～50克/升、KH2PO4 0.1～2.0克/升、MgSO4·7H2O 0.1～2.0克/升、CaCl2·2H2O 0.01～1克/升、NaCl 0.01～1克/升、Fe-EDTA0.01～1克/升、植物生长激素2,4-二氯苯氧乙酸0.001-5毫克/升、苄氨基嘌呤0.001-5毫克/升、脱落酸0.001-5毫克/升、赤霉素0.001-5毫克/升、3-吲哚丁酸0.001-5毫克/升、萘乙酸0.001-5毫克/升、芸苔素0.001-5毫克/升、微量元素2-20ml和水；优选所述微量元素的组成为H3BO30.01-20毫克/升、MnCl2·4H2O 0.01-20毫克/升、ZnSO4·7H2O 0.01-10毫克/升、(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.001-5毫克/升、CuSO4·5H2O 0.001-5毫克/升、NaVO3·4H2O 0.001-5毫克/升、CoCl2·6H2O 0.001-5毫克/升。5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述异养或混养培养的培养基pH为1.0～4.0，优选1.5～2.5；优选所述异养或混养培养的温度为10～70℃，优选25～50℃；优选所述异养或混养培养中控制溶氧在1％以上；优选所述异养或混养培养的周期为1～80天，优选1～30天，更优选5～20天。6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述异养或混养培养微藻过程中，可通过补料将藻液中有机碳源含量控制在0-10g/L的范围内，氮的含量控制在0.5-10mM的范围内，磷的含量控制在0.05-3.5mM的范围内，优选所述异养或混养培养结束时，碳、氮和/或磷等营养成分的浓度基本消耗完毕，例如浓度在0.01mM以下，优选浓度为零；优选当异养或混养培养的培养基中有机碳源消耗完后，结束异养培养；优选所述异养或混养培养可以采用分批培养、补料分批培养、重复补料分批培养、半连续培养或连续培养等方式进行。7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述异养培养时，不需要光照；或所述混养培养是在异养培养的基础上外加光照，光照强度为1-750μmolm-2s-1，其中所述混养培养的光照条件为自然光或人工光，优选所述混养培养中使用连续光照或间歇光照。8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述光自养培养是以...

【专利技术属性】
技术研发人员：李元广，章真，万民熙，王振旸，范建华，黄建科，王骏，王军，王伟良，俞安全，
申请(专利权)人：嘉兴泽元生物制品有限责任公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33