从南极磷虾油中分离具有抗肿瘤活性的全反式脂肪酸的方法技术

本发明专利技术提供了一种从南极磷虾油中分离具有抗肿瘤活性的全反式脂肪酸的方法。将南极磷虾油用硅胶层析偶联制备高效液相色谱进行分离纯化，辅助抗肿瘤活性检测确定有效成分，经高分辨电喷雾电离质谱、核磁共振和激光拉曼散射光谱分别确定有效成分的分子量、结构组成和构型，鉴定出有效成分为全反式EPA和全反式DHA。比较南极磷虾、市售深海鱼油、阿穆尔鲟鱼肝EPA和DHA对多种肿瘤细胞的半数致死浓度发现，南极磷虾油来源的全反式EPA和全反式DHA具有优良的抗肿瘤细胞生长的作用，且对正常对照细胞无明显抑制作用，具有潜在的抗肿瘤候选药物的开发前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种从南极磷虾油中分离具有抗肿瘤活性的天然E型脂肪酸的方法，经鉴定的全反式EPA和DHA对人乳腺癌、肝细胞癌、早幼粒白血病、慢性粒细胞白血病、组织细胞性淋巴瘤等具有显著的抗肿瘤细胞生长的效果。
技术介绍
在过去的几十年内，肿瘤的发病率呈逐年上升趋势，即使有医疗技术的不断进步，肿瘤仍然是和平时期人类死亡的一大病因。研究人员从不同方向研究肿瘤的发生及发展，并研发出以放射线疗法(放疗)、化学疗法(化疗)及外科手术疗法(手术)为主的三大疗法，但三大疗法均存在不同程度的弊端。放疗存在显著的副作用，如食欲不振、脱发、嗜睡、白细胞减少，部分患者还伴有出血等情况；手术疗法对肿瘤发生的前期或前中期效果较好，但肿瘤发生扩散后，手术疗法的效果便变差，并且手术疗法对患者的心理及生理负担皆较大，有些患者会因手术而引起后遗症或并发症，而且手术疗法只能针对实体瘤，对非实体瘤如血癌等无能为力。化疗的药物比较多，逐渐形成合成药、中药或天然产物、生物药物等系列产品，但许多抗肿瘤药物存在特异性差等弊端，有些药物进入患者体内后，杀伤肿瘤细胞的同时也大量杀死患者体内的正常细胞，导致一系列副作用，如脱发、呕吐、恶心及食欲不振等，因此开发一类安全性高、副作用小、抗肿瘤效果好的药物是人们的迫切需要，其中多不饱和脂肪酸的研发曾受到人们的广泛关注。脂肪酸是脂肪、磷脂和糖脂的主要成分，是生命的物质基础。根据其碳链上是否含有不饱和键或双键而分为饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸，含有两个以上不饱和键的脂肪酸被称为多不饱和脂肪酸，如二十碳五烯酸(EPA)及二十二碳六烯酸(DHA)分别含有五个和六个双键。依据其构型脂肪酸又有顺式(Z型)和反式(E型)之别，常见的深海鱼油中的EPA和DHA是Z型的，被认为是极具营养价值和生理活性的ω-3族脂肪酸。已有研究表明，Z-EPA及Z-DHA具有增强人体免疫、抗过敏及促进细胞内脂肪酸代谢等重要作用，而且DHA对婴幼儿神经系统发育也发挥重大作用。自二十世纪七十年代以来，研究人员发现 Z-EPA及Z-DHA具有抑制多种肿瘤细胞生长的能力，如对人早幼粒急性白血病细胞系HL60的半数致死浓度(IC50)分别为85μM和70μM，对人乳腺癌细胞系MCF-7的IC50分别为85±5μM和65±5μM；它们的主要作用机理为诱导肿瘤细胞凋亡或造成肿瘤细胞生长周期阻滞。现阶段由于Z-EPA及Z-DHA必须在高浓度下才可以对多种肿瘤细胞产生杀伤作用，导致其应用受到很大限制。反式(E型)脂肪酸有天然存在和人工制造两种类型，如牛羊奶等乳类制品中含4-9％的E型脂肪酸或酯，而氢化油则是对植物油进行氢化改性产生的一种不饱和脂肪酸，含有14.2-34.3％的E型脂肪酸；共轭亚油酸(CLA)存在一个E型碳碳双键也被归类为E型脂肪酸。这类脂肪酸的生物学功能存在较大争议，尤其在致癌和治癌两个看似对立的方面。有研究表明CLA可以辅助治疗乳腺癌，也有研究认为它可加速乳腺癌的恶性进程，另有研究认为两者之间无相关性，迄今未能形成定论。对E型脂肪酸的研究主要以E-油酸为主，研究认为E-油酸的高摄入量会增加心血管疾病的风险，尤其是冠心病，但对早期生长发育、Ⅱ型糖尿病、高血压、癌症等疾病与反式脂肪的相关性，目前没有明确证据能够证实。E型EPA及DHA作为Z型EPA及DHA的异构体，至今尚未有报道。南极磷虾油脂富含多不饱和脂肪，尤其是ω-3不饱和脂肪酸，其中EPA和DHA含量高达20％以上。通常人们认为南极磷虾中的EPA及DHA都是Z型，具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤等作用，但实际上多为类推，缺乏实验依据。本专利技术采用溶剂萃取、硅胶层析、制备高效液相色谱等方法对南极磷虾油脂进行了分离纯化，通过高分辨电喷雾电离质谱(HRESIMS)、核磁共振、拉曼光谱等技术鉴定两个单一成分为E型EPA和DHA，其抗肿瘤活性优于Z型为主的市售鱼油EPA和DHA，为新型抗肿瘤药物的开发提供了新的线索。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一类具有良好抗肿瘤作用，且安全性高、副作用小的抗肿瘤剂—全反式多不饱和脂肪酸，E型EPA和DHA。用混合溶剂萃取、硅胶层析、制备液相色谱法分离纯化南极磷虾油脂中具有抗肿瘤活性的有效组分，通过气相色谱-质谱联用、液相色谱-质谱联用、高分辨电喷雾电离质谱、核磁共振、拉曼光谱等仪器分析有效成分的结构，并考察它们对多种肿瘤细胞生长的影响，并与市售鱼油EPA和DHA以及鲟鱼肝EPA和DHA进行比较。本专利技术提供一种具有抗肿瘤活性的全反式EPA或全反式DHA，其从南极磷虾油中分离得到。常见的深海鱼油中的EPA和DHA是Z型的，E型EPA及DHA作为Z型EPA及DHA的异构体，至今尚未有抗肿瘤活性报道。本专利技术还提供从南极磷虾油中分离具有抗肿瘤活性的天然全反式EPA或全反式DHA的方法，其包括如下步骤：(1)将南极磷虾油加入至硅胶柱中进行柱层析分离，收集洗脱液，去除溶剂，得到馏分Ⅰ和馏分Ⅱ，馏分Ⅰ为黄色油状物，馏分Ⅱ为鲜红色油状物；(2)馏分Ⅱ用乙腈稀释，用高效制备液相色谱法进行分离，以乙腈和水的混合溶剂系统为流动相进行洗脱，收集洗脱所得不同组分，去除溶剂，依次得到组分Ⅱ-1至Ⅱ-5，均为无色或略带黄色的油状物质，其中组分Ⅱ-2为全反式EPA，组分Ⅱ-4为全反式DHA。进一步地，在步骤(1)所述的柱层析分离中，所述的洗脱液是体积比为7:3-9:1的正己烷和乙醚混合液，混合液中添加体积百分比为1-5％的乙酸。进一步地，步骤(1)中所述的硅胶的粒径为300～400目，硅胶与南极磷虾油的质量比为30～100:1，优选为50～80:1，更优选为60～70:1，层析柱高径比为10～16:1。进一步地，步骤(2)中所述的色谱柱填料为反相C18，粒径10μm，流动相的洗脱程序依次如下：洗脱0-10min之间，用62-68％乙腈洗脱；洗脱10-20min之间，用67-73％乙腈洗脱；洗脱20-60min之间，用72-78％乙腈洗脱，更优选的流动相的洗脱程序依次如下：洗脱0-10min之间，用65％乙腈洗脱；洗脱10-20min之间，用70％乙腈洗脱；洗脱20-60min之间，用75％乙腈洗脱。在上述分离方法中，南极磷虾油上样至硅胶柱，并使用洗脱液进行洗脱，收集洗脱液，每馏分的体积为层析柱保留体积的1/20～1/40，优选为1/30，同时用薄层层析方法检测所得洗脱液中所含的不同极性的物质，合并经检测具有相同极性馏分的洗脱液，在温度20-40℃，压力为-0.08～-0.1Mpa的条件下旋转蒸发去除溶剂，分别得到馏分Ⅰ和馏分Ⅱ，馏分Ⅰ为黄色油状物，馏分Ⅱ为鲜红色油状物。抗肿瘤活性检测结果显示馏分Ⅱ具有较强的抗肿瘤活性，采用制备高效液相色谱柱进一步分离馏分Ⅱ。在上述分离方法中，硅胶柱层析分离得到的馏分Ⅱ进一步用反向C18高效制备液相色谱法进行分离，用乙腈和水的混合溶剂为流动相，流动相的流速不进 行特别限定，本领域技术人员可以根据本领域常规技术，选择适当的流动相流速，可以优选10～20mL/min，更优选15mL/min。在紫外检测210nm处的吸光值，根据出峰时间进行分段收集，在温度20-40℃，压力为-0.08～-0.1Mpa的条件下旋转增发回收溶剂，依次得到组分Ⅱ-1至组分Ⅱ-5。抗肿本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有抗肿瘤活性的天然全反式EPA或全反式DHA的分离方法，包括如下步骤：(1)将南极磷虾油加入至硅胶柱中进行柱层析分离，收集洗脱液，去除溶剂，得到馏分Ⅰ和馏分Ⅱ，馏分Ⅰ为黄色油状物，馏分Ⅱ为鲜红色油状物；(2)馏分Ⅱ用乙腈稀释，用高效制备液相色谱法进行分离，以乙腈和水的混合溶剂系统为流动相进行洗脱，收集洗脱所得不同组分，去除溶剂，依次得到组分Ⅱ‑1至Ⅱ‑5，其中组分Ⅱ‑2为全反式EPA，组分Ⅱ‑4为全反式DHA。

【技术特征摘要】
1.一种具有抗肿瘤活性的天然全反式EPA或全反式DHA的分离方法，包括如下步骤：(1)将南极磷虾油加入至硅胶柱中进行柱层析分离，收集洗脱液，去除溶剂，得到馏分Ⅰ和馏分Ⅱ，馏分Ⅰ为黄色油状物，馏分Ⅱ为鲜红色油状物；(2)馏分Ⅱ用乙腈稀释，用高效制备液相色谱法进行分离，以乙腈和水的混合溶剂系统为流动相进行洗脱，收集洗脱所得不同组分，去除溶剂，依次得到组分Ⅱ-1至Ⅱ-5，其中组分Ⅱ-2为全反式EPA，组分Ⅱ-4为全反式DHA。2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，在步骤(1)所述的柱层析分离中，所述的洗脱液是体积比为7:3-9:1的正己烷和乙醚混合液，混合液中添加体积百分比为1-5％的乙酸。3.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤(1)中所述的硅胶的粒径为300～400目，硅胶与南极磷虾油的质量比为30～100:1...

【专利技术属性】
技术研发人员：修志龙，郑伟龙，王旭东，董悦生，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21