本发明专利技术的目的在于提供一种水产迟钝爱德华氏菌，为迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)ET‑1008株，于2015年8月24日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11270。本发明专利技术的迟钝爱德华氏菌ET‑1008株用于制备疫苗。本发明专利技术筛选的迟钝爱德华氏菌制备的疫苗对牙鲆幼苗进行免疫后，再用ET‑1008株进行攻毒实验；结果表明目前市场上出售的疫苗的免疫效果远低于用本发明专利技术ET‑1008株制成的灭活疫苗的效果。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于水产养殖疫苗用微生物筛选
，具体涉及一种水产迟钝爱德华氏菌。
技术介绍
近年来随着水产养殖业的快速发展，水产养殖动物病害问题也日益突出，其中细菌性疾病已在世界范围内对渔业经济造成了巨大的损失。迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)是一种水产动物重要的致病菌，可以感染包括淡水与海水养殖的多种鱼类，并能在短期内引起大量死亡，给我国水产养殖业带来了巨大经济损失。疫苗的使用可提高养殖鱼类特异性免疫水平，使鱼体产生抵抗特定病原微生物感染的免疫力，不污染环境，无药物残留等问题，是今后鱼类疾病防控的主流发展方向。目前国内外的渔用疫苗大多以注射或浸浴方式接种为主，口服免疫的少有报道。大规模的集约化养殖模式采用注射方式接种疫苗需要耗费大量的人力和时间，同时注射接种往往会对鱼体造上生理损伤，且注射接种对小规格鱼体难以实施。而通过口服免疫接种则操作简便，安全实用，不受鱼体大小的限制，且疫苗的使用量比浸浴免疫更为节省，同时也不存在因浸浴免疫给水体造成的潜在污染问题。因此，口服疫苗的研制和应用已逐渐成为当前鱼类疫苗研究的热点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种水产迟钝爱德华氏菌，从而弥补现有技术的不足。本专利技术提供的迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)ET-1008株，于2015年8月24日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.11270。本专利技术的迟钝爱德华氏菌ET-1008株用于制备疫苗；所述的疫苗为灭活疫苗。本专利技术筛选的迟钝爱德华氏菌制备的疫苗对牙鲆幼苗进行免疫后，再用ET-1008株进行攻毒实验；结果表明目前市场上出售的疫苗的免疫效果远低于用本专利技术ET-1008株制成的灭活疫苗的效果。附图说明图1：迟钝爱德华氏菌菌株ET-1008的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、外膜蛋白ompW及鞭毛蛋白fliC的原核重组表达蛋白的纯化产物电泳图；图2：迟钝爱德华氏菌亚单位口服微胶囊疫苗的表观特性图(×200)；图3：迟钝爱德华氏菌亚单位口服微胶囊疫苗对牙鲆的免疫保护效果图；图4：本专利技术的fliC蛋白与NCBI中的氨基酸序列为SEQ ID NO:3的fliC基因的序列比较图。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本专利技术进行详细说明。实施例1：迟钝爱德华氏菌菌株的分离及其毒力特性分析(1)患病牙鲆取自山东黄岛养鱼厂，病鱼平均体重为(200±5)g，平均体长(20±5)cm，主要症状为腹水、肛门红肿突出、肝脏和肾脏肿大。(2)取腹水症状典型的濒死病鱼，无菌条件下从肝脏、肾脏、腹水等病灶处挑取部分组织，划线于普通营养琼脂平板上，28℃培养24h，挑取形态一致的优势菌落进行纯化培养，直至获得纯培养菌。普通营养琼脂培养基配方为：酵母膏3g，蛋白胨10g，氯化钠15g，蒸馏水1L，pH 7.6-7.8，琼脂20g。(3)将分离获得各菌株纯培养物，在普通营养琼脂平板上进行扩大培养，28℃培养24h后，用0.9％无菌生理盐水洗脱菌落，获得菌悬液，利用比浊法将各菌株的细菌浓度定为1×106CFU/mL，用于注射感染。(4)实验用健康牙鲆每20尾1组，大小规格与患病牙鲆相同，并设生理盐水对照组。养殖水温为20±℃，全天充气，每天换水50％。暂养7d后，腹腔注射0.2mL不同菌株的菌悬液，对照组注射同体积的0.9％无菌生理盐水。定时观察记录，取濒死鱼的病灶及内脏器官进行细菌再分离，所分离优势菌株再次感染牙鲆，观察结果。(5)感染实验结果显示，仅有菌株ET-1008显示出对健康牙鲆具有较高的毒力，可引起90％牙鲆死亡，且死亡牙鲆出现与患病牙鲆相同的症状。因此，证实菌株ET-1008为牙鲆腹水症的病原。且在感染患病的牙鲆体内可再次分离到该菌株。(6)对比实验表明，用目前市场上出售的迟钝爱德华氏菌疫苗对牙鲆幼苗进行免疫后，再用本专利技术筛选的ET-1008株进行攻毒实验；结果表明目前市场上出售的疫苗的免疫效果远低于用本专利技术ET-1008株制成的灭活疫苗的效果。推测是由于ET-1008株的某个致病基因发生变异导致目前疫苗的免疫效果不好。(7)利用常规生理生化鉴定以及6SrRNA和HSP60基因序列分析显示，菌株ET-1008为迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)，并将该菌株于2015年8月24日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.11270。实施例2：迟钝爱德华氏菌菌株ET-1008的GAPDH、外膜蛋白ompW及鞭毛蛋白fliC的原核重组表达(1)目的表达蛋白的序列扩增：根据Genbank迟钝爱德华氏GAPDH、ompW及fliC的基因序列，分别设计其特异性引物(见表1)。利用细菌基因组抽提试剂盒，以抽提细菌基因组DNA为模板，分别配合各基因的正反向引物进行PCR扩增，PCR反应体系及反应条件为：50μl反应体系，包含37μl H2O、5μl 10×Taq buffer、4μl dNTP(2.5mM)、正反引物各1μl、1μl Taq DNA Polymerase及1μl DNA模板；PCR反应程序为94℃变性10min；94℃变性，1min，50℃退火1min，72℃延伸1min，进行30个循环，最后72℃延伸8min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统拍照观察，结果显示GAPDH、ompW及fliC基因扩增成功，且扩增产物大小与目的基因一致(图1)。表1迟钝爱德华氏菌鞭毛蛋白flic、外膜蛋白ompW及GAPDH的引物对扩增产物回收后进行测序，结果表明，获得的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的氨基酸序列为SEQ ID NO:1、外膜蛋白(ompW)的氨基酸序列为SEQ ID NO:2；NCBI比对结果表明上述两种蛋白与NCBI中已公开的序列一直，没有发生变化。但fliC基因的序列与NCBI中已公开的序列存在明显的差异；本专利技术获得的氨基酸序列为SEQ ID NO:4的fliC蛋白相比于NCBI中的氨基酸序列为SEQ ID NO:3的fliC基因存在10个以上氨基的区别(图4)。而免疫效果表明，用氨基酸序列为SEQ ID NO:4的fliC蛋白制成的疫苗对ET-1008株的免疫效果明显好于氨基酸序列为SEQ ID NO:3的fliC蛋白制成的疫苗。(2)GAPDH、ompW及fliC基因表达载体的构建：将扩增的迟钝爱德华氏菌GAPDH、ompW和fliC基因产物切胶回收进行纯化，纯化产物经BamHⅠ和XholⅠ双酶切后,连接至原核表达载体pET32a，分别构建其表达载体pET32a-GAPDH、pET32a-ompW及pET32a-fliC，并将表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)，于含氨苄青霉素的LB平板上培养，待长出菌落后，利用PCR方法筛选阳性克隆表达菌，将PCR检测为阳性克隆的菌株进一步利用测序进行确认。(3)重组蛋白的表达与纯化：经测序确认载体中插入序列正确后，将筛选到的迟钝爱德华氏菌GAPDH、ompW和fliC阳性克隆表达菌分别接种于含氨苄青霉素的LB培养基内，在摇床上培养至指数生长期本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种迟钝爱德华氏菌，其特征在于，所述的迟钝爱德华氏菌的保藏编号为CGMCC No.11270。
【技术特征摘要】
1.一种迟钝爱德华氏菌，其特征在于，所述的迟钝爱德华氏菌的保藏编号为CGMCC No.11270。2.如权利要求1所述的迟钝爱德华氏菌，其特征在于，所述的迟钝爱德华氏菌为ET-100...
【专利技术属性】
技术研发人员：刁菁，叶海斌，王晓璐，于晓清，李乐，
申请(专利权)人：山东省海洋生物研究院，
类型：发明
国别省市：山东;37
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