一种基于ABEI修饰的花状纳米金同时检测土霉素，四环素和卡那霉素的方法。其特征在于：基于微孔板所构建的N‑(4‑氨丁基)‑N‑乙基异鲁米诺(ABEI)‑H2O2‑对碘苯酚(PIP)稳态化学发光系统可以将化学发光时间有效延长。巯基化互补链连接ABEI修饰的花状纳米金被用于信号探针。固定在微孔板上的适配体被用作分子识别元件，将三种抗生素的适配体分别固定在微孔板的三个区域为靶标的同时检测提供了空间上的分辨。所构建的适配体传感器可以实现对土霉素、四环素和卡那霉素的同时检测，在一定的浓度范围内，其化学发光强度与靶标的量呈负对数相关。此外，也将该传感器用于实际样品检测，证明传感器的优良性能。
【技术实现步骤摘要】
一种基于N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺(ABEI)修饰的花状纳米金和微孔板同时检测土霉素，四环素和卡那霉素三种抗生素的方法，涉及纳米材料和分析化学
，用于对食品中土霉素，四环素和卡那霉素进行检测。
技术介绍
土霉素和四环素属于四环素类抗生素，卡那霉素属于氨基糖苷类抗生素，它们都属于光谱抗生素，并在畜牧业中广泛应用。但是，这些抗生素的滥用不仅会对动物自身造成损害，也会对人类产生不良的影响，因为抗生素会在食物链传递过程中富集。这些副作用包括损伤听力，损伤肾脏，引起过敏反应以及诱导人类的动物产生抗药性，此外滥用抗生素也会对环境产生不良的作用。因此欧盟已经对抗生素制定了严格的限量标准，标准规定土霉素、四环素和卡那霉素在牛奶中的最高残留限量分别为100μg/kg,100μg/kg和150μg/kg。即使这样，食品中仍然存在抗生素残留超标的情况，并且往往是多种抗生素残留并存。因此，建立一种快速和高通量的检测方法是至关重要的。根据已经报道的食品中抗生素残留的高通量检测方法。目前为止，能够实现对多组分同时检测的模式主要有两种，一种是多色标记法，一种是空间分辨法。对于多色标记模式而言，其中一个重要的部分就是合成诸如多色荧光标记的纳米材料，多色量子点，时间分辨纳米材料，上转换纳米材料等。而合成多色标记的纳米材料本身不是一项简单的工作，并极大增加了检测方法的难度。此外，在合成多色标记的纳米材料过程中，增加标记物或标记信号的数量是较难实现的，这在很大程度上制约了多组分检测中靶标的种类。然而，基于空间分辨的检测模式可以使用一种通用的标记物而借助空间的分割来实现多组分的检测，在多组分检测中可能具有更广泛的应用。适配体是一段具有三维空间结构的单链DNA或RNA，它可以与靶标发生特异性结合。因此，在生物传感器中，适配体可以被用作一种优良的分子识别元件。适配体在很多方法的优良特性都可以与抗体相媲美。并且，适配体在生物传感方面拥有比抗体更加优良的特性。首先，适配体是在体外设计和筛选的，因此，原则上，任何靶标都可以有它对应的适配体，其次，适配体在信号传导和化学修饰方面具有更加优良的特性。近年来，化学发光方法在食品安全检测方面具有广泛的应用。众所周知，化学发光的实现依赖于化学发光试剂，这些化学发光试剂通常需要额外标记到检测体系中才能实现化学发光的检测。然而，随着纳米材料的不断发展，化学发光试剂标记的纳米材料瘦到越来越多的关注。在我们课题组之前的一篇报道中，我们已经成功合成ABEI修饰的花状纳米金，并且成功构建了ABEI-H2O2-PIP稳态化学发光体系。本专利技术基于微孔板的空间分辨模式，构建了一种新型多组分化学发光检测系统，并成功实现对三种抗生素的同时检测。基于稳态化学发光体系的构建以及ABEI修饰的花状纳米金的合成，为在微孔板上利用鲁米诺型化学发光提供了可能性。专利技术所构建的适配体传感器能利用微孔板自带的空间分辨性能，以及纳米材料 的易修饰性，更适用于高通量和多组分检测。
技术实现思路
：一种基于N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺(ABEI)修饰的花状纳米金和微孔板同时检测土霉素，四环素和卡那霉素三种抗生素的方法。其特征在于：基于微孔板所构建的ABEI-H2O2-对碘苯酚(PIP)稳态化学发光系统可以将化学发光时间有效延长至1500s.巯基化互补链(cDNA)连接ABEI修饰的花状纳米金(ABEI-AuNFs)被用于信号探针。固定在微孔板上的适配体被用作分子识别元件，将三种抗生素的适配体分别固定在微孔板的三个区域为靶标的同时检测提供了空间上的分辨。适配体首先与信号探针通过碱基互补配对而结合，在靶标存在的情况下，适配体会倾向于与靶标结合从而引起信号探针部分脱落，导致化学发光信号强度的变化。因此所构建的适配体传感器可以实现对土霉素、四环素和卡那霉素的同时检测，在一定的浓度范围内，其化学发光强度与靶标的量呈负对数相关。此外，也将该传感器用于实际样品检测，检测结果与商业化ELISA检测方法所得到的结果类似，证明了该传感器的优良性能。所构建的检测方法具有操作简单、选择性和特异性高等优点，在食品安全检测领域尤其是多组分检测方面具有较大的应用潜力。检测步骤为：(1)ABEI-AuNFs纳米材料的制备。首先，将0.075g壳聚糖溶于25mL冰醋酸溶液中(v/v)，然后将1.5mL ABEI储备液和42mL水加入到上述溶液中，在剧烈搅拌下加热至沸腾。将8mL氯金酸储备液逐滴加入，保持沸腾状态2h。之后将材料在室温下自然冷却，保存于4℃备用。(2)ABEI-AuNFs信号探针的制备。取5mL制备好的材料于10000rpm下离心10min，并重悬于1.5mL，30mM Tris-HCl()中。将cDNA和三(2-羧乙基)膦(TCEP)(终浓度100nM)预先在25℃孵育30min。将此混合液与BSA(终浓度1％)共同添加到上述ABEI-AuNFs溶液中，室温下孵育20h。将上述混合液于8000rpm下离心10min得到cDNA修饰的ABEI-AuNFs信号探针探针。(3)适配体包被的微孔板的制备。通过如下步骤将土霉素、四环素、卡纳霉素适配体包被在微孔板的不同区域。首先，取100μL 0.02mg/mL链霉亲合素加入到微孔板中，并在37℃下烘干备用。用0.05％BSA对微孔板上多余的结合位点进行封闭。将微孔板分为3个区域。将100μL生物素化的适配体加入到对应的3个区域中，在37℃下孵育1h，用PB-T洗板3次，并在空气中干燥备用。(4)基于微孔板的ABEI-H2O2-对碘苯酚(PIP)稳态化学发光系统的构建。固定在微孔板上的适配体DNA与其互补DNA单链的杂交，将信号探针固定在微孔板表面，然后向微孔板中加入稳态化学发光缓冲液150μL，缓冲液组成为，0.2mol/L H2O2,0.05mol/L PIP,0.00095mol/L Na2HPO4·2H2O,0.00405mol/LNaH2PO4·12H2O and 0.1mol/L NaOH。(5)对土霉素、四环素、卡纳霉素进行检测，建立标准曲线。向适配体包被的微孔板中加入100μL对应的ABEI-AuNFs信号探针，于37℃下孵育40min，用PB-T洗板3次后，将不同浓度土霉素、四环素和卡纳霉素添加到对应的微孔板中，于37℃下孵育50min，用PB-T洗板3次后加入150mL的检测缓冲 液。30min后测定发光强度。以不同浓度的抗生素的负对数为横坐标，以化学发光强度为纵坐标，建立标准工作曲线。随着靶标浓度的增大，化学发光强度降低，OTC工作曲线的线性范围为0.05-5ng/mL(Y＝-123.688+30.308*X)；TET的性范围为0.05-5ng/mL(Y＝-21.271+22.957*X)；卡那霉素的性范围为0.005-1ng/mL(Y＝-74.064+27.089*X)，它们的最低检测限分别为：0.02/0.02/0.002ng/mL。(6)对土霉素，四环素和卡那霉素样品进行检测：将不同浓度土霉素、四环素、卡纳霉素添加到牛奶样品中，稀释40倍。随后按照(5)中操作步骤得到化学发光强度，从标准曲线中求得对应的靶标的浓度。本专利技术的优点是：(1)利用本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于ABEI修饰的花状纳米金同时检测土霉素，四环素和卡那霉素的方法。其特征在于：基于微孔板所构建的N‑(4‑氨丁基)‑N‑乙基异鲁米诺(ABEI)‑H2O2‑对碘苯酚(PIP)稳态化学发光系统可以将化学发光时间有效延长。巯基化互补链连接ABEI修饰的花状纳米金被用于信号探针。固定在微孔板上的适配体被用作分子识别元件，将三种抗生素的适配体分别固定在微孔板的三个区域为靶标的同时检测提供了空间上的分辨。适配体首先与信号探针通过碱基互补配对而结合，在靶标存在的情况下，适配体会倾向于与靶标结合从而引起信号探针部分脱落，导致化学发光信号强度的变化。因此所构建的适配体传感器可以实现对土霉素、四环素和卡那霉素的同时检测。此外，也将该传感器用于实际样品检测，检测结果与商业化ELISA检测方法所得到的结果类似，证明了该传感器的优良性能。
【技术特征摘要】
1.一种基于ABEI修饰的花状纳米金同时检测土霉素，四环素和卡那霉素的方法。其特征在于：基于微孔板所构建的N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺(ABEI)-H2O2-对碘苯酚(PIP)稳态化学发光系统可以将化学发光时间有效延长。巯基化互补链连接ABEI修饰的花状纳米金被用于信号探针。固定在微孔板上的适配体被用作分子识别元件，将三种抗生素的适配体分别固定在微孔板的三个区域为靶标的同时检测提供了空间上的分辨。适配体首先与信号探针通过碱基互补配对而结合，在靶标存在的情况下，适配体会倾向于与靶标结合从而引起信号探针部分脱落，导致化学发光信号强度的变化。因此所构建的适配体传感器可以实现对土霉素、四环素和卡那霉素的同时检测。此外，也将该传感器用于实际样品检测，检测结果与商业化ELISA检测方法所得到的结果类...
【专利技术属性】
技术研发人员：王周平，郝丽玲，顾华杰，段诺，吴世嘉，马小媛，夏雨，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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