一种紫花苜蓿总黄酮的制备方法及其应用技术

本发明专利技术属于医药技术领域，具体涉及一种紫花苜蓿总黄酮的制备方法及其应用。其制备方法包括如下步骤：a.将紫花苜蓿粉碎，过40目筛；b.超临界CO2提取；c.硅胶柱层析纯化，氯仿‑甲醇洗脱，收集洗脱液；d.浓缩，干燥，即得紫花苜蓿总黄酮。经药效学评价，该提取物抗氧化效果明显，可将其用于制备抗氧化的药品中，具有疗效显著、原料产量大且价格低廉、使用方便等优点，是开发新型高效的天然抗氧化剂的一个好选择。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医药
，具体涉及一种紫花苜蓿总黄酮的制备方法及其应用。
技术介绍
自由基是人体生命活动中多种生化反应的中间代谢产物。细胞在正常的代谢过程中，或者受到高能辐射，以及高压氧、药物、香烟烟雾和光化学空气污染等作用，都会产生自由基。研究表明，自由基从产生到衰亡的过程就是电子转移的过程。在生命体系中，电子的转移是一种最基本的运动，而氧的得电子能力很强，因此，生物体内许多化学反应都与氧有关。研究发现损害人体健康的自由基几乎都与那些活性较强的含氧物质有关，与这些物质相结合的自由基叫做活性氧自由基。活性氧自由基对人体的损害实际上是一种氧化过程。因此，要降低自由基的损害，就要从抗氧化做起。紫花苜蓿为多年生豆科蝶形花亚科车轴草族苜蓿属草本植物。紫花苜蓿的生物活性很多，主要有降低胆固醇、防治动脉粥样硬化、防治冠心病、增强机体免疫力、抑制癌细胞生长以及改善记忆等作用。苜蓿属中见报道的黄酮类成分有70余种，来源于紫花苜蓿的有30余种。苜蓿属中黄酮类成分的母核主要为芹菜素、木犀草素、苜蓿素、金圣草黄素、美迪紫檀素、山奈酚、槲皮素、杨梅黄素、芦丁等。其中，芹菜素、木犀草素、苜蓿素、金圣草黄素、槲皮素等母核的结构均存在于紫花苜蓿中，并以芹菜素、木犀草素、苜蓿素最为常见。据现代医学研究证明，黄酮类化合物分子中含有多电子的羟基部分，使其具有良好的抗氧化性能，是一种天然抗氧化剂，具有清除人体中超氧离子自由基、抗衰老和增加机体免疫力的生理活性作用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于寻求新型高效的天然抗氧化剂的开发利用，提供了一种紫花苜蓿总黄酮的制备方法及其应用。本专利技术是通过如下技术方案完成的，具体内容包括：紫花苜蓿总黄酮的制备方法以及其在制备具有抗氧化作用的药物中的应用。1.一种紫花苜蓿总黄酮的制备方法，包括以下步骤：a.原料处理：将紫花苜蓿粉碎，过40目筛；b.超临界CO2提取：将原料置于萃取釜中，以乙醇为夹带剂，进行超临界CO2萃取，解析，收集紫花苜蓿萃取物；c.硅胶柱层析纯化：以200~300目硅胶为填料，将紫花苜蓿萃取物上柱，氯仿-甲醇梯度洗脱，收集目标洗脱液，浓缩干燥得紫花苜蓿总黄酮。步骤b中所述的超临界萃取温度为40~50℃，萃取压力为30~40MPa，解析温度为20~30℃，解析压力为6~10MPa，解析时间为2~3h，CO2流量为15~20L/h，夹带剂占总萃取剂的体积百分比为4%。步骤c中所述的氯仿-甲醇的体积比为10:3~50:3。2.紫花苜蓿总黄酮在制备具有抗氧化作用的药物中的应用本专利技术获得的紫花苜蓿总黄酮，通过对其抗脂质过氧化能力、清除超氧阴离子自由基（-O2）2能力和清除DPPH自由基能力等指标的研究表明：紫花苜蓿总黄酮具有很强的抗脂质过氧化能力，同时还可以有效清除超氧阴离子自由基和DPPH自由基。因此，紫花苜蓿总黄酮是开发新型高效的天然抗氧化剂的一个好选择。下面将结合具体实施方式进一步说明本专利技术，但本专利技术要求保护的范围并不局限于下列实施方式。具体实施方式：实施例1：将紫花苜蓿粉碎，过40目筛；将原料置于萃取釜中，以占总萃取剂的体积百分比为4%的乙醇为夹带剂，进行超临界CO2萃取，设置萃取温度为40℃，萃取压力为30MPa，解析温度为20℃，解析压力为6MPa，解析时间为2h，CO2流量为15L/h，收集紫花苜蓿萃取物；以200~300目硅胶为填料，将紫花苜蓿萃取物上柱，以体积比为10:3的氯仿-甲醇梯度洗脱，TLC跟踪监测，收集目标洗脱液，浓缩干燥得紫花苜蓿提取物，经UV检测，紫花苜蓿总黄酮的含量为78.6%。实施例2：将紫花苜蓿粉碎，过40目筛；将原料置于萃取釜中，以占总萃取剂的体积百分比为4%的乙醇为夹带剂，进行超临界CO2萃取，设置萃取温度为45℃，萃取压力为35MPa，解析温度为25℃，解析压力为8MPa，解析时间为2.5h，CO2流量为18L/h，收集紫花苜蓿萃取物；以200~300目硅胶为填料，将紫花苜蓿萃取物上柱，以体积比为40:3的氯仿-甲醇梯度洗脱，TLC跟踪监测，收集目标洗脱液，浓缩干燥得紫花苜蓿提取物，经UV检测，紫花苜蓿总黄酮的含量为81.9%。实施例3：将紫花苜蓿粉碎，过40目筛；将原料置于萃取釜中，以占总萃取剂的体积百分比为4%的乙醇为夹带剂，进行超临界CO2萃取，设置萃取温度为50℃，萃取压力为40MPa，解析温度为30℃，解析压力为10MPa，解析时间为3h，CO2流量为20L/h，收集紫花苜蓿萃取物；以200~300目硅胶为填料，将紫花苜蓿萃取物上柱，以体积比为50:3的氯仿-甲醇梯度洗脱，TLC跟踪监测，收集目标洗脱液，浓缩干燥得紫花苜蓿提取物，经UV检测，紫花苜蓿总黄酮的含量为85.1%。具体药效学研究实验：将1g上述3个实施例中所得的紫花苜蓿总黄酮，分别用30%的乙醇将其溶解定容在50mL容量瓶中，记为A、B、C，备用。a.抗脂质过氧化能力的测定分别于样品管中依次加入1mL 10mg/mL卵磷脂溶液（LLS）、1mL 0.4mmol/L硫酸亚铁、1mL上述A、B、C三个样品，混匀，避光于37℃水浴60min，加入2mL三氯乙酸（TCA）-硫代巴比妥酸（TBA）-HCl混合液，90℃~100℃水浴15min，迅速冷却，以3000r/min离心10min，取上清液在535nm测吸光度（As），参比管中以1mL蒸馏水代替1mL卵磷脂。抗坏血酸（VC）为阳性对照。结果见表1。抑制率=[Ac-As/ Ac] ×100%式中：Ac为对照品（以蒸馏水代替样品）的吸光度；As为加入A、B、C三个样品时的吸光度。表1 紫花苜蓿总黄酮抗脂质过氧化能力测定（±S）样品抑制率（%）A41.3B56.1C64.4VC（1mg/mL）16.1VC（2mg/mL）42.9紫花苜蓿总黄酮对Fe2+引发的卵磷脂脂质体过氧化有明显的抑制作用，抑制率随样品中总黄酮含量的增加而增大。由表1可以看出，紫花苜蓿总黄酮抗脂质过氧化能力明显优于抗坏血酸。b.清除超氧阴离子自由基（-O2）2能力的测定采用邻苯三酚自氧化法，取50mmol/L Tris-HCl缓冲溶液（pH=8.2）4.5mL，置于25℃水浴中预热20min，分别加入1mL样品和0.4mL 25mmol/L邻苯三酚溶液，混匀后于25℃水浴中反应5min后，加入8mol/L HCl 0.8mL终止反应。自氧化管以1mL蒸馏水代替样品管中样品，操作方法同样品管，在325nm处测定吸光值，以等体积pH值8.2的Tris-HCl缓冲液为空白。结果见表2：超氧阴离子的清除率=[A0-A1/ A0] ×100%式中：A0为自氧化管的吸光度；A1为样品管的吸光度。表2 紫花苜蓿总黄酮清除超氧阴离子自由基能力测定（±S）样品抑制率（%）A61.14B74.55C89.09VC（1mg/mL）70.18VC（2mg/mL）90.96紫花苜蓿总黄酮对清除超氧阴离子自由基有较好的清除效果，清除率随样品中总黄酮含量的增加而增大。由表2可以看出，紫花苜蓿总黄酮对超氧阴离子自由基的清除率尤为显著，明显强于Vc（在浓度为1mg/mL时，清除率为70.18%）。c.紫花苜蓿总黄酮对DPPH自由基的清除作用在试管中分别加入2.00m本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种紫花苜蓿总黄酮的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：a. 原料处理：将紫花苜蓿粉碎，过40目筛；b. 超临界CO2提取：将原料置于萃取釜中，以乙醇为夹带剂，进行超临界CO2萃取，解析，收集紫花苜蓿萃取物；c. 硅胶柱层析纯化：以200~300目硅胶为填料，将紫花苜蓿萃取物上柱，氯仿‑甲醇梯度洗脱，收集目标洗脱液，浓缩干燥得紫花苜蓿总黄酮。

【技术特征摘要】
1.一种紫花苜蓿总黄酮的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：a. 原料处理：将紫花苜蓿粉碎，过40目筛；b. 超临界CO2提取：将原料置于萃取釜中，以乙醇为夹带剂，进行超临界CO2萃取，解析，收集紫花苜蓿萃取物；c. 硅胶柱层析纯化：以200~300目硅胶为填料，将紫花苜蓿萃取物上柱，氯仿-甲醇梯度洗脱，收集目标洗脱液，浓缩干燥得紫花苜蓿总黄酮。2.根据权利要求1所述的一种紫花苜蓿总黄酮的制备方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨成东，
申请(专利权)人：南京泽朗医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32