无血清培养基制造技术

本发明专利技术公开了一种用于间充质干细胞生长的无血清培养基，所述培养基包含FGF、TGF‑β和脂蛋白。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种无需使用血清作为培养基组分的干细胞生长培养基、利用该培养基的方法以及使用该培养基生产的细胞。
技术介绍
间充质干细胞(MSC)是多潜能细胞，它可以分化成多种细胞类型，包括：成骨细胞(骨细胞)、软骨细胞(软骨的细胞)和脂肪细胞(脂细胞)。这种能力已对活体动物的特定细胞和组织以及他们在组织培养中生长的相应部分证实。MSC是基于细胞的药物发现以及对许多人类疾病的潜在治疗的宝贵资源。MSC治疗包括移植物抗宿主病、多发性硬化症、克罗恩病、1型糖尿病、骨折和骨关节炎等疾病的潜力目前正在临床试验中。据估计，MSC仅占骨髓单核细胞总数的0.001-0.01％；因此，这类群需要广泛的体外细胞培养扩大以获得足够的数量用于基础生物或临床应用。目前临床应用中使用大约1亿个细胞的剂量。再生医学和细胞疗法的目前发展表明，在未来几年里，在细胞加工技术方面会有一个巨大的增长。这将涉及成体和胚胎干细胞，以及用于治疗目的的体细胞。此外，干细胞诱导性多能干细胞在药物筛选应用中使用的增加将大幅增加对细胞加工技术的需求。分离和培养这些MSC大部分依赖于动物制品的使用，特别是胎牛血清(FBS)。干细胞需要特定的生长条件。目前，骨髓来源的MSC在含血清培养基中分离、培养和分化。几乎所有的在实验室培养中生长的哺乳动物细胞都需要在生长培养基中存在FBS，它提供了细胞附着和增殖所必需的激素和生长因子。这包括目前正在研究的用于治疗用途的人类细胞，如成体干细胞、胚胎干细胞以及其他体细胞。FBS是从肉类加工行业得到的胎牛血中获得的，它通常按照体积百分比浓度10％加入到生长培养基中。因此，干细胞的供给依赖于让它们生长的合适培养基的获得。该技术已成功地应用几十年了，FBS是最常用的生长培养基的补充剂，因为胎血中存在蛋白质的复合混合物以及高水平的生长刺激因子。然而，在使用FBS时也存在相关问题，其中一些如下：1.疾病传播到细胞疗法接受者的风险；2.疾病传播到加工技术人员和医务人员的风险；3.产品的不确定性和季节性供应；4.需要在-20℃下冷冻保存；5.批次与批次之间的显著变化；6.因需求增加，预期主要供应链的问题。FBS在用于人类治疗的细胞生产中使用，主要相关问题是传染性物质传播到接受者的风险。此外，还有一个相当大的风险，与处理这些材料的加工技术人员和医务人员相关。这种风险在最近几年变得非常严重，因为传染性牛海绵状脑病(BSE)俗称疯牛病的出现，以及人类获得变异型克雅氏病(vCJD)的相关风险。迄今为止，BSE已在欧洲、北美和世界其他许多地方的牛中被检测到。几乎所有现在批准用于人类治疗的细胞生长中的FBS，都来自澳大利亚和新西兰，这些地方仍然是没有BSE的。BSE在世界各地的牛群中的出现，也导致重大的供应问题，预计会对未来的细胞疗法可用性造成严重影响。目前，这种有限供应的血清一般是足够实验室和研究使用的。然而，这些实验室和研究用途中的某些是针对生产将要进行中型或大型规模生产的商业产品。目前没有批准用于一般性使用的干细胞技术申请。因此，可以设想，当一个干细胞技术被释放为一般性使用时，血清的供应将根本不能满足这种需求。事实上，可以预见的是，当细胞治疗产品被批准仅仅用于两个主要的适应症时，整个全球被批准的供应，即没有BSE的FBS，将会在制造的一年内消耗完。因此，当细胞疗法获得监管部门的批准和使用时，将会出现显著而前所未有的对于无FBS的生长培养基的需求。显然，干细胞生长培养基的供应将会成为干细胞技术的应用的限制因素。此外，FBS是一种异质混合物，这导致血清批次之间缺乏再现性与性能。血清中包含许多不明或非量化的组分，因此不能被“定义”，也不能被再合成制造。因此，批次与批次之间变化的血清组合物，用于实验或其他用途的细胞培养时，使得标准化困难。同时，MSC是贴壁细胞群，目前这种附着到组织培养塑料上的能力大部分依赖于FBS。事实上，由于FBS中的很多组分影响细胞附着、增殖和分化，控制这些参数，或相对于这些参数研究细胞具体要求，可以排除血清的使用。此外，血清的某些组分会抑制特定细胞类型的增殖，并在一定程度上可能抵消其增殖作用，导致次优的生长。这种FBS的异质性引起生长特性的变化导致血清批次间缺乏重现性，导致基于细胞的产品和治疗面临制造和增长的问题。在良好制造协议(GMP)下制造的产品尤其如此，它是以使用一致的(并因此是可靠的)初始材料为先决条件。此外，从治疗和管理的角度来看，FBS的存在是不理想的，因为这可能导致动物病原体的转移。虽然血清被批准用于医疗用途，它可能含有影响实验结果的病毒，或当培养的细胞意图用于植入人体时提供一个潜在的健康危害。此外，从监管的角度来看，在临床设置中使用的动物源性产品是不可取的，不仅是因为有传染性病原体传播的的风险，而且还有引起免疫应答的潜在性。因此，为繁殖和/或产生干细胞，存在对无需添加血清的生长培养基的需求。任何这种新的生长培养基，最好是相对简单，而且易于大量生产。因此，人们已经做出努力，以消除培养基中的FBS，和开发一种能够在活体外(ex vivo)扩增MSC的明确的无血清培养基。WO2011/111787公开了一种细胞制剂，其包含能维持免疫抑制能力的间充质干细胞，由无血清或低血清培养基生产得到。其描述了一种包含间充质干细胞的细胞制剂的制备方法，包括：一增殖步骤，其中间充质干细胞在包含FGF、PDGF、TGF-β、HGF、EGF、至少一种磷脂和至少一种脂肪酸的培养基中进行增殖；和一筛选步骤，其中，增殖步骤后的间充质干细胞经筛选，得到维持或改善免疫抑制能力的间充质干细胞。WO98/104681公开了一种明确的无血清细胞培养基，它包含补充混合物、组分混合物、维生素混合物、无机盐混合物和氨基酸混合物。这种明确的培养基被公开用于培养成纤维细胞，尤其是软骨细胞。该专利技术还公开了一种使用肿瘤生长因子β(TGF-β)增强软骨细胞的分化以及提高软骨特异性基质的合成的方法，以及使用TGF-β和胰岛素样生长因子(IGF)的组合来增强软骨细胞分化的方法。对于MSC的其他培养基也曾被提出。WO 2005/113751公开了MSC在无血清培养基中的扩增；这种培养基是非常复杂的，除其它组分外，有些可以包含bFGF和TGF-β。US2010/0279412也公开了一种无血清培养基，其可包含FGF、TGF、EGF、磷脂酸、磷脂酰胆碱和维生素C。Chase et al,Stem Cell Research&Therapy 2010,1:8公开了一种用于人类MSC的无血清培养基，它包含bFGF、TGF-β1和PDGF。本专利技术的目在于提供一种用于干细胞生长的培养基及方法，其作为上述的至少一个替代，并优选解决或至少改善一个或多个现有技术确认的问题。特定的实施例的目的在于提供一种用于MSC生长的培养基，无需补充血清，因此容易获得而且相对便宜。
技术实现思路
因此，本专利技术提供了用于一种用于培养干细胞的无血清培养基，包括：(a)成纤维细胞生长因子(FGF)；(b)转化生长因子β(TGF-β)；和(c)脂蛋白。本专利技术的一个优点是，它能生产一种完全没有FBS的培养基，即无血清生长培养基，其适合干细胞的增殖和组织培养，尤其是间充质细胞，尤其是人类细胞和组本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种培养间充质干细胞的无血清培养基，其包括：(a)成纤维细胞生长因子(FGF)；(b)转化生长因子β(TGF‑β)；和(c)脂蛋白。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.02.14 EP 14155263.81.一种培养间充质干细胞的无血清培养基，其包括：(a)成纤维细胞生长因子(FGF)；(b)转化生长因子β(TGF-β)；和(c)脂蛋白。2.根据权利要求1所述的培养基，其中该培养基中的脂蛋白浓度为1μg/ml～100μg/ml。3.根据权利要求1-2任一项所述的培养基，其中该培养基的脂蛋白组分包括下述一种或多种：(a)高密度脂蛋白(HDL)；(b)低密度脂蛋白(LDL)；(c)中间密度脂蛋白(IDL)；及(d)极低密度脂蛋白(VLDL)。4.根据权利要求3所述的培养基，其包括LDL。5.根据权利要求4所述的培养基，其中LDL包括下述一种或多种或全部：(a)大而轻LDL(lb LDL)颗粒；(b)小而密LDL(sd LDL)颗粒；和(c)脂蛋白(a)(Lp(a))。6.根据权利要求4或5所述的培养基，其包括直径为15nm～30nm的LDL颗粒。7.根据权利要求3所述的培养基，其包括VLDL。8.根据权利要求7所述的培养基，其包括直径为30nm-80nm的VLDL颗粒。9.根据前面的权利要求任一...

【专利技术属性】
技术研发人员：F·P·巴里，E·J·穆尼，J·M·墨菲，G·M·肖，S·P·盖纳德，
申请(专利权)人：爱尔兰国立高威大学，
类型：发明
国别省市：爱尔兰;IE