本发明专利技术公开了一种单个囊泡融合和回收及其与钙离子通道耦合的膜片钳检测装置，属于神经生物学研究检测仪器领域。其技术方案要点是电脑程序控制下包括膜电容检测模块、钙离子单通道电流检测模块和测量平台。本发明专利技术的用途是为检测单个囊泡融合与回收的动力学特性、钙离子单通道电流特性以及单个囊泡融合和回收与钙离子通道的耦合的动力学特性提供了一种直接、定量、实时以及高时间分辨率、高信噪比、高精度的检测装置。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于科学仪器领域，具体涉及一种用于研究单个囊泡与突触前膜融合与回收的动力学、钙离子单通道电流的动力学，单个囊泡的融合和回收及其与钙离子通道耦合的高精度检测装置。尤其涉及一种用于神经突触传递领域研究以及突触相关神经疾病研究的电生理检测系统。
技术介绍
万亿个神经元构成了一个有序而动态的神经网络。神经突触的联接形成神经信息处理的结构基础，突触神经递质的释放成为神经信息传递的生理基础。当突触前膜去极化或是产生动作电位，Ca2+通过电压门控的钙离子通道流入，与相应的Ca2+感应器结合而触发突触囊泡与突触前膜发生融合形成囊泡的胞吐，神经递质继而释放并与突触后受体结合从而引发突触后神经元的后续电活动，从而完成神经信息的传递和处理，而突触囊泡通过胞吞方式再次回收利用。神经系统完成复杂的功能有赖于其基本单元——神经元之间的高度精确和有效的信息传递。神经递质释放动力学的改变可引起神经系统网络的紊乱并可能导致神经系统疾病的发生。Thomas C.Sudhof发现了Ca2+通过电压门控的钙离子通道流入后与相应的Ca2+感应器synaptogamin结合并触发囊泡融合，从而揭示了囊泡释放被运输物的时间精确性，从而于2013年被授予了诺贝尔奖医学奖。目前为止研究者提出了两种主要的囊泡胞吐和胞吞的方式：全融合方式(full-collapse)和快速胞吐-胞吞(kiss-and-run)方式。一般认为胞吐发生在活性带区域(active zone)，胞吞发生在内吞区(endocytotic zone)，而钙离子是调控突触囊泡胞吐和胞吞的关键信使。因此，钙离子通道与囊泡释放位点的耦合对囊泡的融合至关重要。从某种意义上说，钙通道与囊泡的距离决定了突触传递的动力学特性。利用冷冻断裂技术(freeze-fracture)，并结合电子显微镜或原子力显微镜技术对活性
带区域的结构分析，从而对囊泡融合位点与钙离子通道的空间分布估算显示：钙离子通道呈簇状分布，且与囊泡的距离小于20nm，显示两者之间的高度耦合关系。检测突触前囊泡胞吐和胞吞的方法主要有电子显微图像、光学显微荧光成像、膜片钳突触后电流间接推测方法和全细胞膜电容测量法。其中，膜片钳全细胞膜电容测量技术是通过对全细胞膜电容的检测，得到细胞膜面积的改变，观测囊泡与细胞膜融合以及囊泡回收的现象。具有直接、定量和实时显示的优势。然而这种方法受突触终末的电学性质的局限很大。在早期，这一技术主要用于对嗜铬细胞、肥大细胞和颗粒细胞等分泌细胞的单个囊泡与细胞膜融合时产生的膜电容进行检测。之后通过提高信噪比成功地对神经胶质瘤细胞中单个囊泡与细胞膜的融合进行电容检测。近年来，这一技术已成功地用于观察中枢神经分泌和神经突触，实现了毫秒级时间分辨率精度上对中枢神经细胞突触前终末进行突触囊泡释放和回收相关的全细胞膜电容记录。但是它的实现是通过对270万个自发性突触后电流进行叠加后计算得到单个囊泡的膜电容，虽然提高了检测精度，但是它是一种间接的手段。近年来用细胞贴附式膜电容检测技术将膜电容记录精度提高到观测单个突触囊泡的水平，并且可以对kiss-and-run和全融合方式的胞吞胞吐进行区分，但是其检测精度难以应用于对中枢神经系统单个囊泡进行检测。关键点在于信噪比，只有将信噪比提高，将噪声峰峰值水平降低到50aF以下才有可能检测到中枢神经系统单个囊泡的活动。钙离子内流驱动突触囊泡释放神经递质的动力学，即钙离子通道与单个囊泡胞吐胞吞的耦合是神经科学领域具有挑战性且引起广泛兴趣的一个重要问题。对于理解局部钙信号传递和突触的生理过程，解释突触可塑性的机制以及钙缓冲剂的作用，揭示大脑中信息的处理和编码的机理至关重要。目前对这个问题的研究主要有两种方法。第一种是通过对神经递质释放的速率和突触前终扣钙通道电流之间对数-对数的关系进行分析，得到的斜率被称为钙电流与囊泡融合的协同(cooperativity)。它间接的提供了钙离子通道与囊泡胞吐的耦合关系以及活性带的形态特征。通过这种分析方法得到在大鼠的calyx突触中，不同类型的钙离子通道电流N、P/Q和R型具有不同的协同作用。其中P/Q型高于N和R型，表明P/Q型钙离子
通道与囊泡间的距离小于另外两种类型。随着发育，囊泡融合速率明显加快而所需开放的钙离子通道数目减少，表明成熟突触的钙通道与钙感受器的耦合更加紧密。在神经肌肉接头上，人们曾用建模仿真技术推测，Ca2+可以通过一个或是两个钙离子通道驱动单个囊泡融合。通过突触前终扣内注入钙离子螯合剂BAPTA和EGTA后进行的突触传递动力学分析提供了另一种，可以分析钙通道与Ca2+感受器耦合的方法。在幼龄动物(出生后～8-10天)的calyx of Held突触中，Ca2+与钙感应器的平均耦合距离小于100nm。而在成熟(出生后～16-18天)的calyx of Held突触中，耦合距离小于20nm。上述两种方法基于全细胞记录进行检测，通过间接的方式得到钙通道与囊泡释放的耦合关系。其缺点是难以确认参与囊泡融合耦合的部分钙通道，且难以区分full collapse和kiss-and-run两种融合回收方式。
技术实现思路
本专利技术优化了现有的细胞贴附式膜片钳膜电容检测方法，降低了系统噪声，将细胞贴附式膜片钳电容检测方法拓展到应用于中枢神经系统单个囊泡融合和回收的检测，并在检测单个囊泡活动的同时对钙通道电流进行检测，为研究单个突触囊泡及其与钙离子通道的耦合提供了一种直接的、高精度的，高分辨率的检测系统。为了实现上述目的，本专利技术提供了以下方面：本专利技术的第一方面提供一种膜片钳检测装置，所述装置包括膜电容检测模块、钙离子单通道电流检测模块和测量平台，其中所述膜电容检测模块包括膜片钳放大器EPC-8(安装电容校准按钮的EPC-8，HEKA)、锁相放大器(SR850，Stanford Research Instrument，U.S.A.)、第一带阻滤波器(Quest Scientific Instruments)和第二带阻滤波器；所述钙离子单通道电流信号检测模块包括膜片钳放大器EPC-10、第三带阻滤波器、贝塞尔滤波器(Frequency Devices INC.,Tunable acitve filter900)；所述测量平台包括光学显微镜(Olympus Corporation)(带有物镜和目镜)与高精度样本操作平台(Sutter Instrument,ROE-200)(包括微操纵器和载物台)，计算机工作站与AD/DA数据交换接口(BNC-2090，National Instruments，U.S.A)
和红外相机(DVC Company，710M-00-FW)以及灌流浴槽。在一个优选的实施方案中，其中所述膜片钳放大器EPC-8的参数设置为慢电容补偿(C-slow)：10pF range；慢电容补偿数值：0.2pF；串联电阻补偿：off；串联电导补偿数值：0.2μS；增益：20-50mV/pA；滤波器：Full；刺激比例因子：0.1；TR：2μS。在一个优选的实施方案中，其中所述锁相放大器的参数设置为时间常数：1ms，24dB；信号输入：input：A，couple：AC，ground：Fl本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种膜片钳检测装置，所述装置包括膜电容检测模块、钙离子单通道电流检测模块和测量平台，其中所述膜电容检测模块包括安装电容校准按钮的膜片钳放大器EPC‑8、锁相放大器、第一带阻滤波器和第二带阻滤波器；所述钙离子单通道电流信号检测模块包括膜片钳放大器EPC‑10、第三带阻滤波器、贝塞尔滤波器；所述测量平台包括光学显微镜、高精度样本操作平台、计算机工作站与AD/DA数据交换接口和红外相机以及灌流浴槽。
【技术特征摘要】
1.一种膜片钳检测装置，所述装置包括膜电容检测模块、钙离子单通道电流检测模块和测量平台，其中所述膜电容检测模块包括安装电容校准按钮的膜片钳放大器EPC-8、锁相放大器、第一带阻滤波器和第二带阻滤波器；所述钙离子单通道电流信号检测模块包括膜片钳放大器EPC-10、第三带阻滤波器、贝塞尔滤波器；所述测量平台包括光学显微镜、高精度样本操作平台、计算机工作站与AD/DA数据交换接口和红外相机以及灌流浴槽。2.根据权利要求1所述的膜片钳检测装置，其中所述膜片钳放大器EPC-8的参数设置为慢电容补偿(C-slow)：10pF range；慢电容补偿数值：0.2pF；串联电阻补偿：off；串联电导补偿数值：0.2μS；增益：20-50mV/pA；滤波器：Full；刺激比例因子：0.1；TR：2μS。3.根据权利要求1所述的膜片钳检测装置，其中所述锁相放大器的参数设置为时间常数：1ms，24dB；信号输入：input：A，couple：AC，地(ground)：Float；灵敏度：1Vr.m.s.；滤波：Line&2*Line；通道1：输出(Output)：X，Offset：Off，Ration：Off，Expand：1；通道2：输出(Output)：X，Offset：Off，Ration：Off，Expand：1；正弦波频率20KHz；...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈培华，孙坚原，申雪峰，戴金叶，张树利，
申请(专利权)人：中国科学院生物物理研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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