一株高效厌氧砷还原菌制造技术

本发明专利技术涉及一株高效厌氧砷还原菌，属于环境微生物领域。该菌株经16S rDNA序列分析，DNA‑DNA杂交鉴定为嗜碱菌属的一个新种，命名为Alkaliphilus sp.IMB,其保藏编号为CGMCC 1.5191。该菌株生长最适pH范围为9.0，最适盐浓度为10‑15g·L‑1，对As(III)的最小抑菌浓度为5mM，对As(V)的最小抑菌浓度为40mM。在厌氧条件下，120h可还原80％以上的As(V)。该菌株具有有厌氧砷还原酶的结构基因arrA，同步辐射研究发现砷还原发生在细胞膜上。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一株高效厌氧砷还原菌，属于环境微生物领域，该菌株可在厌氧条件下利用细胞膜上的砷还原酶Arr蛋白进行砷的高效还原。
技术介绍
砷是自然界中广泛存在的一种致畸致癌物质，在自然水体中主要以三价和五价形式存在。三价砷具有较强迁移性，且毒性是五价砷的25-60倍。自然环境中进化出一些可以抗砷的微生物，其中砷还原菌是砷抗性微生物的主要类群，包括好氧砷还原菌和厌氧砷还原菌。好氧砷还原菌的还原机制是其胞质内可以合成ArsC还原酶，将五价砷还原为三价砷；厌氧砷还原菌的还原机制是其细胞膜上可合成Arr还原酶，该酶可以将五价砷还原为三价砷。砷还原微生物在自然界的砷地球化学循环中起了非常重要的作用。目前的研究主要集中于好氧微生物参与的砷的地球化学循环，关于砷厌氧微生物的还原研究起步晚，研究基础比较薄弱。本专利技术从内蒙河套平原地区土壤中筛选分离到一株高效厌氧砷还原菌，该菌株对于研究该地区自然水体等厌氧环境中的砷迁移转化有重要的指导意义。
技术实现思路
本
技术实现思路
的目的在于提供一株高效厌氧砷还原菌株。根据本专利技术的一个具体实施方式，分离筛选到一株高效厌氧砷还原菌株，经鉴定为嗜碱菌属的一个新种菌株Alkaliphilus sp.IMB。该菌株的保藏单位是中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC 1.5191。根据本专利技术的一个具体实施方式，高效厌氧砷还原菌株Alkaliphilus sp.IMB形貌特征在于：杆状，端生芽孢，革兰氏阳性。生长最适pH范围为9.0，最适盐浓度为10-15g·L-1。根据本专利技术的一个具体实施方式，Alkaliphilus sp.IMB的砷抗性特征为：三价砷最小生长抑制浓度为5mM,五价砷最小抑制浓度为40mM。在厌氧条件下，120h可还原80％以上的As(V)。根据本专利技术的一个具体实施方式，Alkaliphilus sp.IMB的砷抗机理为：五价砷被厌氧砷还原酶的结构基因arrA还原为三价砷，同步辐射研究发现砷还原发生在细胞膜上。附图说明附图1为本专利技术的高效厌氧砷还原菌Alkaliphilus sp.IMB的系统发育地位图。从图中可以看出，该菌株是Alkaliphilus的菌株。附图2为本专利技术的高效厌氧砷还原菌Alkaliphilus sp.IMB的形态特征图。从图中可以看出，其为杆状，端生芽孢。附图3为本专利技术的高效厌氧砷还原菌Alkaliphilus sp.IMB的生长pH和盐度的特征图。从图中可以看出，该菌的最适生长pH为9，最适生长盐度为10-15g·L-1。附图4为本专利技术的高效厌氧砷还原菌Alkaliphilus sp.IMB的五价砷还原动力学及生长曲线特征图。从图中可以看出，菌株对五价砷的还原从细胞的对数生长期开始，可以在120h内还原80％以上的五价砷。附图5为本专利技术的高效厌氧砷还原菌Alkaliphilus sp.IMB砷还原酶ArrA蛋白的arrA基因电泳图，其中M：ladder；a：阳性对照菌株PCR扩增得到的ArrA结构基因arrA条带；b:Alkaliphilus sp.IMB扩增得到的arrA条带。附图6为1mL五价砷胁迫配体体系中Alkaliphilus sp.IMB的同步辐射光谱分析结果。其中A:As(III)和As(V)标样的As LIII边NEXAFS图谱；B与C:分别为As(III)和As(V)在细胞周围分布的扫描透射X射线显微图像(黑色杆状和球状物质代表细胞)。具体实施方式实施例1高效厌氧砷还原菌Alkaliphilus sp.IMB分离纯化、鉴定及保藏(1)菌株的分离将1g土壤样品加入到10mL CDM培养基中，在30℃条件下避光培养72h，所有的操作都在厌氧手套箱中进行。每72h取1％的培养液转接到新鲜的CDM培养基中，如此重复3次后，取1mL培养液过0.22μm的滤膜，测定砷的价态和含量。选择具有砷还原能力的菌群作为目标菌群，利用亨特滚管技术进行分离纯化得到Alkaliphilus sp.IMB。CDM培养基的组分：0.225g K2HPO4；0.225g KH2PO4；0.117g MgSO4·7H2O；0.46g NaCl；0.225g(NH4)2SO4；0.424g Na3AsO4；4.2g NaHCO3；2.24g乳酸钠；1.0g酵母粉；微量元素混合液10mL，维他命溶液10mL；1L H2O,13g琼脂。(2)细菌总DNA的提取从固体平板上挑取单菌落接种于20mL CDM液体培养基，30℃避光厌氧培养72h。4℃12000r/min离心5min收集菌体，用1mL TE洗涤菌体两次后，加入1mL TE将菌体充分悬浮，加入溶菌酶0.001g混匀，于37℃水浴放置至液体澄清，底部有碎片为止。向液体中加入5μL的RNase(10mg/mL)，37℃水浴30min，加入10％SDS 200μL，60～65℃处理至液体澄清。加入蛋白酶K粉末少许，37℃处理1～2小时，再向液体中加入1/5体积5M NaClO4。用等体积苯酚：氯仿：异戊醇抽提1～2次，12000r/min离心15min收集上清，用等体积氯仿：异戊醇抽提1～2次，12000r/min离心10min收集上清。在上清中加入1/10体积3M NaAc，2倍体积无水乙醇于-20℃沉淀30min，用玻璃棒挑出沉淀出的DNA，加入70％乙醇中过夜处理去盐。最后将晾干后的DNA溶于400mL ddH2O中，-20℃保存待用。(3)16S rDNA的扩增以原核生物的模式菌株大肠杆菌的16S rDNA序列设计引物，如表1所示：表1 16S rRNA基因的引物以提取基因组DNA为模板，PCR扩增16S rDNA序列，扩增体系和扩增程序如下：扩增体系16S rDNA的扩增程序：得到了1.5Kb左右的条带，将此条带进行回收纯化，并送交测序。测序结果进行在线的BLAST比对，并利用Mage5软件构建菌株的系统发育地位，结果如附图1所示，该菌株为嗜碱菌属菌株。该菌株Alkaliphilus sp.IMB已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号CGMCC 1.5191。实施例2厌氧砷还原菌Alkaliphilus sp.IMB生长特性的研究(1)菌株形貌将Alkaliphilus sp.IMB培养至对数期，收集菌体。用0.1M PBS配置的2.5％的戊二醛溶液将细菌样品固定2h。将样品浸泡在1％锇酸中2h，用酒精梯度脱水，包埋在树脂(Epon 812，Fenwal，US)中。超薄切片机切出70nm的切片，将其捞在铜网上，用醋酸铀和柠檬酸铅进行染色后，用TEM观察。(2)菌株生长pH将Alkaliphilus sp.IMB培养到对数期。按照1％的接种量分别接种到不同pH的新鲜CDM培养基中(pH 6，pH 7，pH 8，pH 9，pH 10，pH11，pH12，pH 13)，每隔6h测一次OD600，记录并绘制随时间变化的OD600曲线。(3)菌株生长盐度生长将Alkaliphilus sp.IM本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株高效厌氧砷还原菌，其特征在于：成团泛菌属菌株，命名为Alkaliphilus sp.IMB。

【技术特征摘要】
1.一株高效厌氧砷还原菌，其特征在于：成团泛菌属菌株，命名为Alkaliphilus sp.IMB。2.如权利要求1所述的一株高效厌氧砷还原菌，其特征在于：杆状，端生芽孢，革兰氏阳性菌，该菌株生长最适pH范围为9.0，最适盐浓度为10-15g·L-1。3.如权利要求1所述的一株高效厌氧砷还原菌，其特征在于：三价砷最小生长抑...

【专利技术属性】
技术研发人员：景传勇，王莉瑛，田海霞，
申请(专利权)人：中国科学院生态环境研究中心，
类型：发明
国别省市：北京;11