一种提高植物对入侵的DNA 病毒的抵御能力的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高植物对入侵的DNA病毒的抵御能力的方法。本发明专利技术提供了培育对DNA病毒的抵御能力提高的植物的方法，包括如下步骤：1)从待抵御的DNA病毒的基因组序列中选取符合5’‑NX‑NGG‑3’或5’‑CCN‑NX‑3’排列规则的序列作为靶序列；针对所述靶序列设计合成与之反向互补的DNA片段；2)将所述DNA片段构建到用于表达CRISPR/Cas9核酸酶的载体中，得到能转录向导RNA和表达Cas9蛋白的重组载体；所述向导RNA中的crRNA含有由所述DNA片段转录所得的RNA片段；3)将所述重组载体导入受体植物后从中获得对所述DNA病毒抵御能力提高的植物。本发明专利技术方法仅仅基于病毒的基因组序列，不需要了解病毒基因的具体功能，所以该方法可广泛应用于抵御序列已知的各种双链DNA病毒及以DNA双链为中间体的单链DNA病毒。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物基因工程领域，涉及一种提高植物对入侵的DNA病毒的抵御能力的方法。
技术介绍
DNA病毒广泛存在于自然界中，并在细菌，动物以及植物中具有广范性的宿主。已知的DNA病毒中多数会引起严重的传染性疾病，并给经济性作物和哺乳动物(包括人类)带来巨大的损失。以双生病毒为例，双生病毒是存在于植物中的唯一一类具有孪生颗粒形态的单链DNA病毒，也是目前已知的最大的单链DNA病毒家族。其基因组类型可分为单组份和双组份，大小约2.5-3.1kb。其通过昆虫介体以持久性的方式传播，大多数侵染寄生植物的韧皮部组织。目前已报道双生病毒主要对番茄、木薯、棉花等作物造成巨大的经济损失。1991-1992年，美国佛罗里达番茄受该病毒感染损失1.4亿美元；1992-1997年，棉花曲叶病毒造成巴基斯坦损失50亿美元；全球木薯每年损失达10亿英镑；1999年，Science杂志专题报告“双生病毒正在成为作物的严重威胁”来阐明双生病毒的危害性。传统的抵御双生病毒的方式主要针对于阻断DNA病毒的复制或干扰其致病蛋白的表达。以双生病毒为例，其复制方式是较为保守的。在侵染宿主细胞后，病毒DNA会表达一个与复制相关的蛋白，该蛋白会结合在病毒基因组复制起点并起始DNA病毒的复制。当双生病毒的单链DNA进入到宿主细胞后，首先会依据单链DNA合成互补链，并形成双链中间体dsDNA，而病毒只编码了复制蛋白Rep和复制增强蛋白Ren，Rep蛋白结合在双链DNA复制起点，并在其保守序列TAATATTAC进行切割产生切口，从而起始滚环复制。因此，通过转入全长或部分外源Rep蛋白可与双生病毒自身编码的Rep蛋白进行竞争，从而抑制双生病毒的复制。然而，高表达量、干扰宿主细胞生长、非普适性使得该技术具有巨大的劣势。另外有
报道利用RNAi技术来干扰病毒致病蛋白的表达从而达到抗病毒的目的。该技术也因为其同源依赖性的特点而不具有普适性。2005年，Takashi Sera利用锌指结合蛋白特异性结合DNA双链的特性，研发了一种抑制双生病毒复制的方法。其以甜菜严重曲顶病毒(Beet severe curly top virus，BSCTV)为模式，通过转入外源人工锌指蛋白(AZP)，与病毒复制起始蛋白Rep进行竞争，并结合于病毒“双链中间体”复制起点，从而阻碍其复制。然而该方法只针对于双生病毒具有Rep蛋白作为其复制起始蛋白为特性的一类DNA双生病毒，而并不对DNA病毒具有广谱抗性。近些年来的研究发现，细菌中存在一种适应性免疫反应系统，能够特异性的清除入侵细菌的外源双链DNA片段，包括噬菌体和质粒。这种免疫系统由成簇的规律间隔短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat sequences,CRISPR)、反式作用CRISPR RNA(trans-acting CRISPR RNA,tracrRNA)基因和CRISPR相关基因(CRISPR-associated genes,Cas gene)组成。病毒的某些DNA片段会被记录在CRISPR重复序列之间。继而表达出包含病毒序列的CRISPR RNA。当病毒再次入侵时，CRISPR RNA在tracrRNA的协同作用下，引导Cas基因编码的核酸内切酶识别并清除外源病毒双链DNA。根据Cas基因核心元件序列的不同，CRISPR/Cas免疫系统被分为三种类型：I型、II型和III型。其中I型和III型需要由多个Cas基因编码的蛋白组成复合体，完成对双链DNA的切割；而II型只需要Cas9蛋白即可切割双链DNA。所以，目前应用最广泛的是II型CRISPR/Cas系统。最近有研究发现，利用人工合成的方法，可以将crRNA和tracrRNA改造成一个融合的向导RNA(single-guide RNA,sgRNA)，并利用这种sgRNA成功引导Cas9内切酶实现对DNA的定点切割。如果能使真核生物具备与细菌的CRISPR/Cas类似的这套系统，将能够显著提高真核生物的抗病毒能力。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种培育对DNA病毒的抵御能力提高的植物的方法。本专利技术所提供的培育对DNA病毒的抵御能力提高的植物的方法，具体
可包括如下步骤：(1)从待抵御的DNA病毒的基因组序列中选取若干靶序列；针对各所述靶序列，分别设计合成与所述靶序列反向互补的DNA片段(双链)；所述靶序列为符合5’-NX-NGG-3’或5’-CCN-NX-3’序列排列规则的序列；N表示A、G、C和T中的任一种，14≤X≤30，且X为整数，NX表示X个连续的脱氧核糖核苷酸；(2)将步骤(1)获得的若干个所述DNA片段分别构建到用于表达CRISPR/Cas9核酸酶的载体中，得到若干个重组载体；所述重组载体能转录向导RNA和表达Cas9蛋白；所述向导RNA为由crRNA和tracrRNA通过碱基配对结合而成的具有回文结构的RNA；所述crRNA含有由所述DNA片段转录所得的RNA片段；(3)将若干个所述重组载体分别导入受体植物，从导入所述重组载体的受体植物中获得对所述DNA病毒抵御能力提高的植物；所述DNA病毒为双链DNA病毒或以DNA双链为中间体的单链DNA病毒。本专利技术还提供了一种培育对DNA病毒的抵御能力提高的植物的方法，其包括如下步骤：1)从所述DNA病毒的基因组序列中选择靶序列，所述靶序列具有5’-NX-NGG-3’或5’-CCN-NX-3’的序列，其中N表示选自A、G、C和T中任一种的脱氧核糖核苷酸；14≤X≤30，且X为整数；NX表示X个连续的脱氧核糖核苷酸；2)构建用于表达CRISPR/Cas9核酸酶的重组载体，所述载体能够转录向导RNA和表达Cas9蛋白；所述向导RNA特异性靶向步骤1)所述的靶序列；3)将所述重组载体导入所述植物，从而获得对所述DNA病毒抵御能力提高的植物。在一些实施方式中，所述DNA病毒为双链DNA病毒或以DNA双链为中间体的单链DNA病毒。所述用于表达CRISPR/Cas9核酸酶的重组载体能转录向导RNA和表达Cas9蛋白。所述向导RNA为由crRNA和tracrRNA通过碱基配对结合而成的具有回文结构的RNA。本专利技术的另一个目的是提供一种提高植物抵御DNA病毒的能力的方法。本专利技术所提供的提高植物抵御DNA病毒的能力的方法，具体可包括如下步骤：(a)按照包括如下步骤的方法获得目的DNA片段：(a1)从待抵御的DNA病毒的基因组序列中选取若干靶序列；针对各所述靶序列，分别设计合成与所述靶序列反向互补的DNA片段(双链)；所述靶序列为符合5’-NX-NGG-3’或5’-CCN-NX-3’序列排列规则的序列；N表示A、G、C和T中的任一种，14≤X≤30，且X为整数，NX表示X个连续的脱氧核糖核苷酸；(a2)将步骤(a1)获得的若干个所述DNA片段分别构建到用于表达CRISPR/Cas9核酸酶的载体中，得到若干个重组载体；所述重组载体能转录向导RNA和表达Cas9蛋白；所述向导RNA为由crRNA和tracrRNA通过碱基配对结合而成的具有回文结构的RNA；所述crRNA含有由所述DNA片段转录所得本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种培育对DNA病毒的抵御能力提高的植物的方法，包括如下步骤：(1)从待抵御的DNA病毒的基因组序列中选取若干靶序列；针对各所述靶序列，分别设计合成与所述靶序列反向互补的DNA片段；所述靶序列为符合5’‑NX‑NGG‑3’或5’‑CCN‑NX‑3’序列排列规则的序列；N表示A、G、C和T中的任一种，14≤X≤30，且X为整数，NX表示X个连续的脱氧核糖核苷酸；(2)将步骤(1)获得的若干个所述DNA片段分别构建到用于表达CRISPR/Cas9核酸酶的载体中，得到若干个重组载体；所述重组载体能转录向导RNA和表达Cas9蛋白；所述向导RNA为由crRNA和tracrRNA通过碱基配对结合而成的具有回文结构的RNA；所述crRNA含有由所述DNA片段转录所得的RNA片段；(3)将若干个所述重组载体分别导入受体植物，从导入所述重组载体的受体植物中获得对所述DNA病毒抵御能力提高的植物；所述DNA病毒为双链DNA病毒或以DNA双链为中间体的单链DNA病毒。

【技术特征摘要】
2015.03.12 CN 20151010749291.一种培育对DNA病毒的抵御能力提高的植物的方法，包括如下步骤：(1)从待抵御的DNA病毒的基因组序列中选取若干靶序列；针对各所述靶序列，分别设计合成与所述靶序列反向互补的DNA片段；所述靶序列为符合5’-NX-NGG-3’或5’-CCN-NX-3’序列排列规则的序列；N表示A、G、C和T中的任一种，14≤X≤30，且X为整数，NX表示X个连续的脱氧核糖核苷酸；(2)将步骤(1)获得的若干个所述DNA片段分别构建到用于表达CRISPR/Cas9核酸酶的载体中，得到若干个重组载体；所述重组载体能转录向导RNA和表达Cas9蛋白；所述向导RNA为由crRNA和tracrRNA通过碱基配对结合而成的具有回文结构的RNA；所述crRNA含有由所述DNA片段转录所得的RNA片段；(3)将若干个所述重组载体分别导入受体植物，从导入所述重组载体的受体植物中获得对所述DNA病毒抵御能力提高的植物；所述DNA病毒为双链DNA病毒或以DNA双链为中间体的单链DNA病毒。2.一种提高植物抵御DNA病毒的能力的方法，包括如下步骤：(a)按照包括如下步骤的方法获得目的DNA片段：(a1)从待抵御的DNA病毒的基因组序列中选取若干靶序列；针对各所述靶序列，分别设计合成与所述靶序列反向互补的DNA片段；所述靶序列为符合5’-NX-NGG-3’或5’-CCN-NX-3’序列排列规则的序列；N表示A、G、C和T中的任一种，14≤X≤30，且X为整数，NX表示X个连续的脱氧核糖核苷酸；(a2)将步骤(a1)获得的若干个所述DNA片段分别构...

【专利技术属性】
技术研发人员：高彩霞，姬祥，张华伟，
申请(专利权)人：中国科学院遗传与发育生物学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11