本发明专利技术公开了山核桃miR169在提前植物花期中的应用。应用山核桃miR169，有望调控山核桃的花期，使得山核桃童期缩短，提前开花，结实。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因功能领域，更具体地涉及山核桃miR169在提前植物花期中的应用。
技术介绍
MicroRNA(miRNA)是一类广泛存在于动植物中，含有茎环结构的miRNA前体，经过Dicer加工之后的一类非编码的小RNA分子(18-25个核苷酸)。miRNA通过在转录水平或者转录后水平对基因组上的靶基因抑制其翻译或者切割靶基因来调控基因表达，在基因表达中起负调控其靶基因作用。miRNA在植物从成花诱导到花器官特征属性形成的整个花发育过程均发挥着关键作用。miR169是一种广泛存在于单子叶植物和双子叶植物中的miRNA。在拟南芥中，miR169的靶基因为NF-Y家族成员，通过抑制NF-YA基因转录来调控胁迫应答，同时miR169过表达促进拟南芥提前开花。通过Solexa测序发现，miR169在山核桃营养生长阶段表达量为1.12，在生殖生长阶段的表达量为8.26，生殖生长是营养生长表达量的7.3倍，表明miR169与花发育存在一定的关系。为了研究miR169的功能，通过转山核桃miR169基因，探索其在植物发育中的作用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供山核桃miR169在提前植物花期中的应用。本专利技术提供了山核桃miR169在提前植物花期中的应用，所述山核桃miR169的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。在一个实施例中，所述植物是拟南芥或烟草。在一个实施例中，所述植物是拟南芥。在一个实施例中，获得山核桃miR169转基因植株的具体方法包括：将包含所述山核桃miR169的前体基因连接到载体上，通过农杆菌介导转化到拟南芥、筛选、培养和获得转基因株系。由于山核桃miR169本身序列很短(GGCAGTCTCCTTGGCTAATC)，只有20bp，而前体序列相对较长，连接到载体上，有利于转化实现，优选地，所述前体基因的碱基序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术的优点在于，应用山核桃miR169，有望调控山核桃的花期，使得山核桃童期缩短，提前开花，结实。附图说明图1为为山核桃花芽的总RNA；图2为山核桃miR169前体的表达载体菌液PCR检测；图3为山核桃miR169转基因拟南芥植株的抗性筛选；图4为野生型(WT)和山核桃miR169转基因拟南芥的叶片数目统计；图5为观察到的野生型(WT)和山核桃miR169转基因拟南芥的表型。具体实施方式1.材料1.1实验材料山核桃雌花芽、根、茎、叶、果实均采自浙江省杭州市临安板桥村，选取同一株山核桃树进行采样。样品采下后立即液氮保存，带回实验室并放置在-80℃冰箱保存待用。拟南芥种子使用哥伦比亚生态型(Columbia-0)。1.2实验试剂与仪器DNA聚合酶、各种限制性内切酶、T4连接酶、Marker和TRIzol试剂均购自宝生物工程(大连)有限公司；质粒提取试剂盒及DNA胶回收试剂盒购自上海生工生物工程股份有限公司。PCR仪为美国PE9700 PCR仪，超净工作台购自苏州诚净净化科技有限公司。1.3引物合成及测序引物合成及测序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。2.方法2.1山核桃花芽总RNA的提取采用改良CTAB+Trizol法提取花芽样品总RNA，步骤如下：(1)在10mL离心管中加入3mL 65℃预热的CTAB提取缓冲液(10％CTAB，10％PVP40，1.0M Tris-HCl(pH 8.0)，5M NaCl，0.6M EDTA(pH 8.0))，加入200μL β-巯基乙醇；(2)取-70℃保存的花芽2g，放入液氮充分预冷的研钵中，于液氮中充分研磨至百色粉末；(3)将白色粉末迅速转入预热的提取液中，立即充分振荡混匀，65℃水浴30min，期间振荡3-4次；(4)在混合物中加入等体积的25:24:1(酸性饱和酚：氯仿：异戊醇)，约3ml。混合均匀后14000rpm离心10min(常温)；(5)取上清转入新的10ml离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)上下颠倒混匀，12000rpm 4℃离心10min后取上清；(6)重复步骤4一次，直至中间层消失；(7)上清转移至1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇后放置于-20℃冰箱冷冻30min。12000rpm 4℃离心10min弃掉上清，沉淀加入65℃预热好的SSTE 400μL溶液至全溶；(8)溶液中加入1mL TRIzol试剂，室温静置5min。再加入200μL氯仿摇匀，室温静置2-3min；(9)4℃12000rpm离心15min；(10)吸取上清，加入等体积异丙醇，室温静置10min；(11)4℃12000rpm离心10min，弃掉上清，肉眼可见RNA沉于管底；(12)加入1mL预冷的75％乙醇洗涤沉淀，温和振荡，8000rpm 4℃离心5min，弃掉上清；(13)重复步骤11，并将沉淀真空干燥7-10min；加入适量DEPC水溶解沉淀，-80℃保存备用。2.2 cDNA合成使用TAKARA试剂盒Prime ScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit，详细内容如下：(1)在经过DEPC处理过的PCR管中配置下列反应体系:(2)65℃保温5min，冰上迅速冷却。(模板RNA变性)(3)再次配置反应体系如下：(4)缓慢摇匀。(5)42℃反应30-60min。(6)95℃5min酶失活后，冰上冷却。2.3前体序列的引物设计依据前体序列：TCTTGTATGCAAAAATAAATATATATAGTAGTGTTCATGATGAGGGATGTTCAGACGTTGCAGTTCGAAGAAGAGAAGACCTGGCATGAGAATGAAGAGACTGTAAGATTAGCCAAGGAGACTGCCTACGAATCACAGAAAGAGTTTCTAGGGATCCAAACACACAAAACTACTAATTATATCTTGAAGCCGCTTGGAGGAGCAGGCAAGTCATCCTTGGCTACCAAACAAAGACTCTTATCCTCATGATAGATCTCTCCTCTCAAAAATATATTTCCTTA，使用Primer Primer 5.0设计引物，引物两端分别加上酶切位点KpnI和XbaI，正向引物：5’-GGGGTACCGATGAGGGATGTTCAGACGT-3，反向引物：5’-GCTCTAGATTGTTTGGTAGCCAAGGATG-3’，克隆所需序列。2.4 PCR扩增反应以山核桃cDNA为模板扩增，反应体系如下：PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min。30个循环后，72℃延伸10min。PCR反应完成后4℃暂时保存，其中退火温度可根据Tm值进行调整。2.5琼脂糖凝胶电泳检测与胶回收将PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液为TAE(40mM Tris-乙酸盐，1mMEDTA)，核酸燃料为EB。紫外光检测电泳结果并回收PCR产物。利用上海生工公司的DNA胶回收试剂盒进行胶回收，具体步骤如下：(1)通过琼脂糖凝胶电泳尽可能将目的DNA片段与其他片段分开，用干净的手术刀片将含有目的DNA的琼脂糖凝胶块切下，放入1.5mL离心管中。每个胶块尽量不要超过400mg，否则将会导致溶胶不完全。另外切胶过程应尽本文档来自技高网...
【技术保护点】
山核桃miR169在提前植物花期中的应用，其特征在于，所述山核桃miR169的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.山核桃miR169在提前植物花期中的应用，其特征在于，所述山核桃miR169的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物是拟南芥或烟草。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物是拟南芥。4.根据权利...
【专利技术属性】
技术研发人员：王正加，孙志超，舒李露，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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