一种萱草种质脱毒复壮方法技术

本发明专利技术提供了一种萱草种质脱毒复壮方法，该种质脱毒复壮方法详细步骤包括：（1）选材待接种萱草花蕾；（2）配制萱草花药诱导培养基；（3）花药消毒与接种；（4）花药诱导培养；（5）花药愈伤组织分化与生根培养；（6）萱草幼苗的炼苗与移栽；（7）非二倍体萱草植株的剔除。本发明专利技术的萱草种质脱毒复壮方法通过萱草花药培养途径获得了萱草花粉植株，进而剔除花培群体中的非二倍体萱草杂株获得萱草二倍体植株，该种质脱毒复壮方法脱毒效果显著，可以将萱草种质复壮，极大提高萱草的品质和产量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及园林科学领域，尤其涉及一种通过花药培养途径高效脱除萱草病毒从而大大提升萱草种质的品质和产量的萱草种质脱毒复壮方法。
技术介绍
萱草（Hemerocallis fulva）是百合科、萱草属的多年生宿根草本，别名萱花菜、忘忧草、宜男草等，原产中国，被称为中国的“母亲花”。萱草品种繁多，花色鲜艳，花型优美，广为人民所喜爱。《本草纲目》曰：“萱草本作谖。谖，忘也。”古人以为萱草可以使人忘忧，故谓之忘忧草。《风土记》中记载：“‘妊妇佩其草则生男’，故称为宜男”。我国的萱草种植历史久远、种质资源丰富，自古以来被人们视为传统的名花、名菜，亦为名药。有关萱草的一句俗语称其“观为花、食为菜、用为药”。可见萱草其身价值颇多、功用颇广。萱草生长强健，适应性强，喜湿润也耐旱，喜阳光又耐半荫，被广泛应用于园林中的花丛、花境、地被、花坛等配植。近年来，随着生态节约型绿化理念的推广，宿根花卉在园林绿化中广泛应用，人们对萱草新品种的需求也越来越大，我国萱草的生产面积逐年增大，因此萱草栽培有着广泛的应用前景和很高的经济价值。目前，商业上萱草主要采用茎芽扦插繁殖法、分株繁殖法、组织培养法等无性繁殖为主，长期的无性繁殖将会使萱草体内逐渐积累大量病毒致使植物发生病毒病，如黄瓜花叶病毒、百合潜隐病毒等，并导致种性退化。病毒病对萱草的危害表现主要有：植株严重矮化，花叶畸形，坏死斑，产量下降，种质明显退化，开花少且小，有的甚至盲花，严重时整株枯死，严重制约了我国萱草的品质和产量。减少和消除萱草病毒病、生产优质无毒种苗是萱草种球商品化生产面临的一个重要问题。目前，生产上主要是通过热处理、组培茎尖脱毒和化学处理等方法进行脱毒。然而，目前的萱草脱毒方法并不完善，各种脱毒方法均有其不足之处。热处理是利用病毒和植物对温度敏感性的差异不同，利用高温对植物进行处理，高温使病毒钝化，在植物体内很难繁殖，部分植物细胞耐高温加速细胞分裂和繁殖，从而获得无病毒的新生植物组织部分，再进一步繁殖得到无病毒苗，然而热处理不能脱除所有病毒，且影响萱草存活率；茎尖培养脱毒是利用病毒在植物体内分布不均匀，在根尖和茎尖病毒含量很少或不含病毒，因此，采用茎尖离体培养的方法可以脱除病毒，其缺点是植物的存活率很低；化学处理法是将抗病毒药剂注射进植物体内或者加入培养基中，以达到除去病毒的目的，一般要与茎尖组织培养相结合应用，可一定程度的提高茎尖脱毒效率和存活率。花药离体培养是把花粉发育到一定阶段的花药接种到培养基上，来改变花药内花粉粒的发育程序，使其分裂形成细胞团，进而分化成胚状体，形成愈伤组织，由愈伤组织再分化成植株的一种技术，花药培养主要用途为培育单倍体植株，由于小孢子基本不携带病毒，通过花药培养培育的植株几乎能达到完全脱毒的目的，因此，若将离体的萱草花药培育成单倍体植株，进而选择萱草的单倍体植株加倍的正常植株来育苗，可以较好的达到萱草脱毒的目的。然而，目前萱草花药培养的体系并未建立，但百合科其它种的花药培养得到的不少的研究，且成功培育出了花培株，我们在百合科其它种植物的花培体系的基础上，尝试并摸索萱草花药培养的适用培养基和培养条件，建立起了一种适用于萱草花药培养的体系，采用该花培体系可以将萱草小孢子成功培育成二倍体植株，从而达到对萱草种质脱毒复壮的目的，我们的研究结果对于萱草的种质培育具有较大的意义。
技术实现思路
专利技术的目的是针对现有技术存在的缺陷，提供了一种通过花药培养途径高效脱除萱草病毒从而大大提升萱草种质品质和产量的萱草种质脱毒复壮方法。本专利技术的目的是通过以下技术方案解决的：一种萱草种质脱毒复壮方法，其特征在于：该种质脱毒复壮方法的详细步骤如下：（1）选材待接种萱草花蕾在萱草正常现蕾开花季节，选择大部分花药处于单核晚期的花蕾，用冰壶带回实验室，用湿润的纱布包裹后置于4℃冰箱中低温预处理3-5d；（2）配制萱草花药诱导培养基萱草花药诱导培养基按每升蒸馏水中由以下物质配制而成：大量元素：KNO3 2500～2700mg/L，NH4NO3 1600～1800mg/L，KH2PO4 440～480mg/L，MgSO4∙7H2O 350～390mg/L，CaCl2∙2H2O 820～860mg/L；微量元素：MnSO4∙4H2O 20～25mg/L，ZnSO4∙7H2O 8.0～9.0mg/L，H3BO3 6.0～6.5mg/L，KI 0.8～0.85mg/L，CuSO4∙5H2O 0.02～0.03mg/L，CoCl∙6H2O 0.02～0.03mg/L，NaMoO4∙2H2O 0.2～0.3mg/L；铁盐：Na2-EDTA∙2H2O 35～40mg/L，FeSO4∙7H2O 25～30mg/L；有机成分：肌醇 90～110mg/L，维生素B1 0.09～0.11mg/L，维生素B6 0.45～0.55mg/L，烟酸 0.45～0.55mg/L，甘氨酸 1.8～2.2mg/L，丝氨酸 0.75～0.85mg/L，谷氨酞胺 0.75～0.85mg/L；激素：2，4-D 3.2～3.6mg/L，KT 2.0～2.4mg/L；凝固剂：植物凝胶 6.0～6.5g/L；活性添加剂：椰乳14～16g/L，甘露醇20～24g/L，水解蛋白 0.8～1.0g/L，活性炭 0.35～0.45g/L；碳源：蔗糖27～33g/L，麦芽糖13～17g/L；将大量元素、微量元素、铁盐、有机成分和激素分别配制成一定浓度倍数的母液贮备，配制时，预先量出配制培养基总量一半体积的蒸馏水，分别加入一定体积或质量的大量元素、微量元素、铁盐、有机成分、活性添加剂，定容，加热至60-80℃，然后加入碳源、凝固剂和激素，搅拌至沸腾后，培养基完全融解，停止加热，调节pH为5.8-6.0，然后将培养基分装于500ml的三角瓶中，每瓶盛120ml～150ml的培养基，密封后置于温度为121℃、压力为15kPa高压蒸汽条件下灭菌20min，自然冷却凝固；（3）花药消毒与接种萱草花蕾低温预处理后，将花蕾用自来水冲洗10～20min，在超净工作台无菌条件下，先用75%酒精消毒2min，再用0.1%升汞+2-3滴吐温-80消毒15min，无菌水冲洗3～4次后，从花蕾中取出带有花丝的花药，接种到步骤（2）的萱草花药诱导培养基上；（4）花药诱导培养将接种花药后的培养基进行花药诱导培养，45-60d后诱导出萱草花药愈伤组织；（5）花药愈伤组织分化与生根培养无菌条件下将诱导成功的萱草花药愈伤组织转接到分化培养基上，光照条件下分化培养25-40d，萱草分化出大量的绿芽，将高于1.5cm的小芽切下，转接入生根培养基上生根培养，35d后即观察到萱草绿苗发育出旺盛的根系；（6）萱草幼苗的炼苗与移栽将萱草幼苗的三角瓶封口膜打开炼苗，7～10d后将幼苗从三角瓶中取出，清洗掉根部的培养基残留，移栽入温室内，遮荫一周后，常规大田栽培；（7）非二倍体萱草植株的剔除移栽后的萱草生长到现蕾期时，根据植株高度差异，将群体植株高度后20%和前20%的植株剔除。所述的萱草为二倍体萱草，即体细胞含2n=22条染色体的萱草品种。所述步骤（1）的萱草花药诱导培养基的最佳配方为：按每升蒸馏水中由以下物质本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种萱草种质脱毒复壮方法，其特征在于：该种质脱毒复壮方法的详细步骤如下：（1）选材待接种萱草花蕾在萱草正常现蕾开花季节，选择大部分花药处于单核晚期的花蕾，用冰壶带回实验室，用湿润的纱布包裹后置于4℃冰箱中低温预处理3‑5d；（2）配制萱草花药诱导培养基萱草花药诱导培养基按每升蒸馏水中由以下物质配制而成：大量元素：KNO3 2500～2700mg/L，NH4NO3 1600～1800mg/L，KH2PO4 440～480mg/L，MgSO4∙7H2O 350～390mg/L，CaCl2∙2H2O 820～860mg/L；微量元素：MnSO4∙4H2O 20～25mg/L，ZnSO4∙7H2O 8.0～9.0mg/L，H3BO3 6.0～6.5mg/L，KI 0.8～0.85mg/L，CuSO4∙5H2O 0.02～0.03mg/L，CoCl∙6H2O 0.02～0.03mg/L，NaMoO4∙2H2O 0.2～0.3mg/L；铁盐：Na2‑EDTA∙2H2O 35～40mg/L，FeSO4∙7H2O 25～30mg/L；有机成分：肌醇 90～110mg/L，维生素B1 0.09～0.11mg/L，维生素B6 0.45～0.55mg/L，烟酸 0.45～0.55mg/L，甘氨酸 1.8～2.2mg/L，丝氨酸 0.75～0.85mg/L，谷氨酞胺 0.75～0.85mg/L；激素：2，4‑D 3.2～3.6mg/L，KT 2.0～2.4mg/L；凝固剂：植物凝胶 6.0～6.5g/L；活性添加剂：椰乳14～16g/L，甘露醇20～24g/L，水解蛋白 0.8～1.0g/L，活性炭 0.35～0.45g/L；碳源：蔗糖27～33g/L，麦芽糖13～17g/L；将大量元素、微量元素、铁盐、有机成分和激素分别配制成一定浓度倍数的母液贮备，配制时，预先量出配制培养基总量一半体积的蒸馏水，分别加入一定体积或质量的大量元素、微量元素、铁盐、有机成分、活性添加剂，定容，加热至60‑80℃，然后加入碳源、凝固剂和激素，搅拌至沸腾后，培养基完全融解，停止加热，调节pH为5.8‑6.0，然后将培养基分装于500ml的三角瓶中，每瓶盛120ml～150ml的培养基，密封后置于温度为121℃、压力为15kPa高压蒸汽条件下灭菌20min，自然冷却凝固；（3）花药消毒与接种萱草花蕾低温预处理后，将花蕾用自来水冲洗10～20min，在超净工作台无菌条件下，先用75%酒精消毒2min，再用0.1%升汞+2‑3滴吐温‑80消毒15min，无菌水冲洗3～4次后，从花蕾中取出带有花丝的花药，接种到步骤（2）的萱草花药诱导培养基上；（4）花药诱导培养将接种花药后的培养基进行花药诱导培养，45‑60d后诱导出萱草花药愈伤组织；（5）花药愈伤组织分化与生根培养无菌条件下将诱导成功的萱草花药愈伤组织转接到分化培养基上，光照条件下分化培养25‑40d，萱草分化出大量的绿芽，将高于1.5cm的小芽切下，转接入生根培养基上生根培养，35d后即观察到萱草绿苗发育出旺盛的根系；（6）萱草幼苗的炼苗与移栽将萱草幼苗的三角瓶封口膜打开炼苗，7～10d后将幼苗从三角瓶中取出，清洗掉根部的培养基残留，移栽入温室内，遮荫一周后，常规大田栽培；（7）非二倍体萱草植株的剔除移栽后的萱草生长到现蕾期时，根据植株高度差异，将群体植株高度后20%和前20%的植株剔除。...

【技术特征摘要】
1.一种萱草种质脱毒复壮方法，其特征在于：该种质脱毒复壮方法的详细步骤如下：（1）选材待接种萱草花蕾在萱草正常现蕾开花季节，选择大部分花药处于单核晚期的花蕾，用冰壶带回实验室，用湿润的纱布包裹后置于4℃冰箱中低温预处理3-5d；（2）配制萱草花药诱导培养基萱草花药诱导培养基按每升蒸馏水中由以下物质配制而成：大量元素：KNO3 2500～2700mg/L，NH4NO3 1600～1800mg/L，KH2PO4 440～480mg/L，MgSO4∙7H2O 350～390mg/L，CaCl2∙2H2O 820～860mg/L；微量元素：MnSO4∙4H2O 20～25mg/L，ZnSO4∙7H2O 8.0～9.0mg/L，H3BO3 6.0～6.5mg/L，KI 0.8～0.85mg/L，CuSO4∙5H2O 0.02～0.03mg/L，CoCl∙6H2O 0.02～0.03mg/L，NaMoO4∙2H2O 0.2～0.3mg/L；铁盐：Na2-EDTA∙2H2O 35～40mg/L，FeSO4∙7H2O 25～30mg/L；有机成分：肌醇 90～110mg/L，维生素B1 0.09～0.11mg/L，维生素B6 0.45～0.55mg/L，烟酸 0.45～0.55mg/L，甘氨酸 1.8～2.2mg/L，丝氨酸 0.75～0.85mg/L，谷氨酞胺 0.75～0.85mg/L；激素：2，4-D 3.2～3.6mg/L，KT 2.0～2.4mg/L；凝固剂：植物凝胶 6.0～6.5g/L；活性添加剂：椰乳14～16g/L，甘露醇20～24g/L，水解蛋白 0.8～1.0g/L，活性炭 0.35～0.45g/L；碳源：蔗糖27～33g/L，麦芽糖13～17g/L；将大量元素、微量元素、铁盐、有机成分和激素分别配制成一定浓度倍数的母液贮备，配制时，预先量出配制培养基总量一半体积的蒸馏水，分别加入一定体积或质量的大量元素、微量元素、铁盐、有机成分、活性添加剂，定容，加热至60-80℃，然后加入碳源、凝固剂和激素，搅拌至沸腾后，培养基完全融解，停止加热，调节pH为5.8-6.0，然后将培养基分装于500ml的三角瓶中，每瓶盛120ml～150ml的培养基，密封后置于温度为121℃、压力为15kPa高压蒸汽条件下灭菌20min，自然冷却凝固；（3）花药消毒与接种萱草花蕾低温预处理后，将花蕾用自来水冲洗10～20min，在超净工作台无菌条件下，先用75%酒精消毒2min，再用0.1%升汞+2-3滴吐温-80消毒15min，无菌水冲洗3～4次后，从花蕾中取出带有花丝的花药，接种到步骤（2）的萱草花药诱导培养基上；（4）花药诱导培养将接种花药后的培养基进行花药诱导培养，45-60d后诱导出萱草花药愈伤组织；（5）花药愈伤组织分化与生根培养无菌条件下将诱导成功的萱草花药愈伤组织...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋晓燕，张瑞明，潭江，
申请(专利权)人：连云港秀景园林绿化工程有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32