用于酶变体的自动筛选的方法、装置和系统制造方法及图纸

公开了用于从复杂的生物分子文库或此类文库的组中鉴定具有期望特性(或最适合于一轮定向进化)的生物分子的方法。本公开内容的一些实施方案提供了用于虚拟筛选蛋白的有利特征的方法。本公开内容的一些实施方案提供了虚拟筛选酶的期望活性和/或选择性用于牵涉特定底物的催化反应的方法。一些实施方案结合筛选和定向进化，以设计并开发具有期望的特性的蛋白和酶。还提供了实施所述方法的系统和计算机程序产品。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本申请基于35U.S.C.§119(e)要求于2013年9月27日提交，标题为：AUTOMATEDSCREENINGOFENZYMEVARIANTS(酶变体的自动筛选)的美国临时专利申请号61/883,838的权益，为了所有的目的通过引用将其以其整体并入本文。背景蛋白设计长久以来被认为是艰巨的任务，只因为一个原因，构成可搜索的序列空间的可能分子的组合式激增。蛋白的序列空间是极大的，并且使用本领域目前已知的方法彻底地搜索是不可能的，本领域目前已知的方法通常被鉴定有用的多肽所需的时间和成本所限制。问题的一部分由必须要测序、筛选和测定的多肽变体的巨大的量而引起。定向进化方法提高了深入研究具有有益特征的候选生物分子的效率。如今，蛋白的定向进化由往往迭代进行的多种高通量筛选和重组方式主导。用于搜索序列-活性空间的多种计算技术也已被提出。相对来说，这些技术处于其初期，并仍然需要重大进展。因此，用于提高筛选、测序和测定候选生物分子的效率的新方法是高度期望的。概述本公开内容涉及分子生物学、分子进化、生物信息学和数字化系统的领域。还提供了用于执行这些方法的系统(包括数字化系统)和系统软件。本公开内容的方法在优化用于工业和治疗用途的蛋白方面具备实用性。所述方法和系统对于设计和开发对特定底物的催化反应具有期望的活性和选择性的酶是尤其有用的。本公开内容的某些方面涉及用于虚拟地筛选(virtuallyscreening)具有有益特征的蛋白和/或引导定向进化程序的方法。本公开内容提供了用于从复杂的生物分子文库或此类文库的组中鉴定具有期望的特性(或最适合朝向此类特性的定向进化)的生物分子的方法。本公开内容的一些实施方案提供了筛选酶的期望活性和选择性用于虚拟筛选对特定底物的催化反应的方法。一些实施方案结合筛选和定向进化，以设计并开发具有期望特性的蛋白和酶。还提供了实施这些方法的系统和计算机程序产品。本公开内容的一些实施方案提供了用于用底物筛选多个不同酶变体的活性的方法。在一些实施方案中，该方法使用包括一个或更多个处理器和系统存储器的计算机系统来实施。所述方法包括：(a)对于每一个酶变体，通过计算机系统将底物的计算表示与酶变体的活性位点的计算表示对接，其中，对接(i)产生底物在活性位点中的多个位姿(pose)；以及(ii)鉴定底物在活性位点中的能量上有利的位姿；(b)对于每一个能量上有利的位姿，确定位姿是否是有活性的，其中，活性位姿满足使底物经历在活性位点中的催化的一个或更多个限制；以及(c)选择被确定为具有一个或更多个活性位姿的酶变体中的至少一个。在一些实施方案中，限制包括以下的一个或更多个：位置、距离、角度和扭转限制。在一些实施方案中，限制包括底物上的特定部分和活性位点中的特定残基或残基部分之间的距离。在一些实施方案中，限制包括配体上的特定部分和活性位点中的理想地定位的天然配体之间的距离。在一些实施方案中，底物的计算表示代表沿着对于酶活性的反应坐标的种类。所述种类选自底物、底物的反应中间体或底物的过渡态。在一些实施方案中，被筛选的变体选自可转换多个底物的一组酶，并且其中，该组的成员相对于参考序列具有至少一个突变。在一些实施方案中，至少一个突变是单残基突变。在一些实施方案中，至少一个突变位于酶的活性位点中。在一些实施方案中，多个变体包含能够催化选自以下的化学反应的一种或更多种酶：酮还原、转氨基作用、氧化、腈水解、亚胺还原、α,β-不饱和羰基化合物还原(enonereduction)、酰基水解和卤代醇脱卤作用。在一些实施方案中，酶选自酮还原酶、转氨酶、细胞色素P450、Baeyer–Villigerd单加氧酶、单胺氧化酶、腈水解酶、亚胺还原酶、α,β-不饱和羰基化合物还原酶、酰基转移酶和卤代醇脱卤素酶。然而，不意图本专利技术被限制为任何特定的酶或任何特定种类的酶，因为任何适合的酶可用在本专利技术的方法中。在一些实施方案中，变体是由体外和/或计算机模拟的一轮或更多轮的定向进化产生的文库的成员。在一些实施方案中，该方法筛选至少约十个不同的变体。在其他实施方案中，该方法筛选至少约一千个不同的变体。在一些实施方案中，活性位点的计算表示由对于多个变体的3-D同源模型提供。在一些实施方案中，提供了用于产生对于蛋白变体的3-D同源模型的方法。在一些实施方案中，该方法被应用于筛选多种底物。一些实施方案提供了这样的方法，该方法通过当天然底物经历由野生型酶催化的化学转化时鉴定天然底物的一个或更多个位姿、天然底物的反应中间体、或天然底物的过渡态来鉴定底物经历催化的化学转化的限制。一些实施方案提供了用于将一个或更多个酶限制的组应用于多个酶变体的方法，其中，一个或更多个酶限制与当天然底物在野生型酶的存在下经历催化的化学转化时野生型酶的限制相似。在一些实施方案中，底物的多种位姿通过包括以下的一个或更多个的对接操作来获得：高温分子动力学、随机旋转、通过基于网格的模拟退火的改进和最终的基于网格的最小化或全力场最小化。在一些实施方案中，配体的多个位姿包括底物在活性位点中的至少约10个位姿。在一些实施方案中，以上(c)中的变体的选择包括通过与其他变体比较鉴定被确定为具有大量活性位姿的变体。在一些实施方案中，(c)中的选择包括通过以下的一个或更多个对变体排序：变体具有的活性位姿的数目、活性位姿的对接得分以及活性位姿的结合能量。然后基于排序来选择变体。在一些实施方案中，对接得分是基于范德华力和静电相互作用。在一些实施方案中，结合能量是基于以下的一个或更多个：范德华力、静电相互作用和溶剂化能。在一些实施方案中，筛选方法还包括制备包含至少一个所选择的变体的至少一部分或编码至少一个所选择的变体的至少一部分的多个寡核苷酸。该方法还包括使用多个寡核苷酸进行一轮或更多轮定向进化。在一些实施方案中，制备多个寡核苷酸包括使用核酸合成仪合成寡核苷酸。在一些实施方案中，进行一轮或更多轮定向进化包括片段化和重组多个寡核苷酸。在一些实施方案中，进行一轮或更多轮的定向进化包括对多个寡核苷酸进行饱和诱变。在一些实施方案中，所筛选的酶变体具有期望的催化活性和/或选择性。一些实施方案的方法还包括合成从筛选中选择的酶。在一些实施方案中，筛选方法可被扩展以筛选除了酶以外的生物分子。一些实施方案提供了用于筛选多个蛋白变体与配体相互作用的方法。该方法包括：(本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于用底物筛选多个不同的酶变体的活性的方法，所述方法使用包括一个或更多个处理器和系统存储器的计算机系统来实施，所述方法包括：(a)对于每一个酶变体，通过所述计算机系统将所述底物的计算表示与所述酶变体的活性位点的计算表示对接，其中，对接(i)产生所述底物在所述活性位点中的多个位姿；以及(ii)鉴定所述底物在所述活性位点中的能量上有利的位姿；(b)对于每一个能量上有利的位姿，确定所述位姿是否是有活性的，其中，活性位姿满足使所述底物经历在所述活性位点中的催化的一个或更多个限制；以及(c)选择被确定为具有一个或更多个活性位姿的酶变体中的至少一个。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.09.27 US 61/883,8381.一种用于用底物筛选多个不同的酶变体的活性的方法，所述方法
使用包括一个或更多个处理器和系统存储器的计算机系统来实施，所述方
法包括：
(a)对于每一个酶变体，通过所述计算机系统将所述底物的计算表示与
所述酶变体的活性位点的计算表示对接，其中，对接(i)产生所述底物在所
述活性位点中的多个位姿；以及(ii)鉴定所述底物在所述活性位点中的能量
上有利的位姿；
(b)对于每一个能量上有利的位姿，确定所述位姿是否是有活性的，其
中，活性位姿满足使所述底物经历在所述活性位点中的催化的一个或更多
个限制；以及
(c)选择被确定为具有一个或更多个活性位姿的酶变体中的至少一个。
2.如权利要求1所述的方法，还包括：通过产生化学反应筛选在(c)
中针对所述底物选择的至少一个酶变体。
3.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述底物的所述计
算表示代表沿着对于所述酶活性的反应坐标的种类，所述种类选自所述底
物、所述底物的反应中间体或所述底物的过渡态。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述多个酶变体包
括能够转化多种底物的一组酶，，并且其中，所述组的成员相对于参考序
列具有至少一个突变。
5.如权利要求4所述的方法，其中，所述至少一个突变是所述酶的
所述活性位点中的单残基突变。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述多个变体包括
能够催化选自以下的化学反应的一种或更多种酶：氧化还原、转移、水解、
异构化、连接以及通过除了水解、氧化或还原以外的反应破坏化学键。
7.如权利要求6所述的方法，其中，所述酶选自氧化还原酶、转移

\t酶、水解酶、异构酶、连接酶和裂解酶。
8.如权利要求6所述的方法，其中，所述多个变体包括能够催化选
自以下的化学反应的一种或更多种酶：酮还原、转氨基作用、氧化、腈水
解、亚胺还原、α,β-不饱和羰基化合物还原、酰基水解和卤代醇脱卤作用。
9.如权利要求8所述的方法，其中，所述酶选自酮还原酶、转氨酶、
细胞色素P450、Baeyer–Villigerd单加氧酶、单胺氧化酶、腈水解酶、亚
胺还原酶、α,β-不饱和羰基化合物还原酶、酰基转移酶和卤代醇脱卤素酶。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述多个变体包括
由体外和/或计算机模拟的一轮或更多轮定向进化产生的文库的成员。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述多个变体包括
至少约十个不同的变体。
12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述多个变体包括
至少约一千个不同的变体。
13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，活性位点的所述计
算表示由对于所述多个变体的3-D同源模型提供。
14.如权利要求13所述的方法，所述方法还包括产生对于所述多个
变体的所述3-D同源模型。
15.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述底物的所述计
算表示是所述底物的3-D模型。
16.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法被应用于
筛选多种底物。
17.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括通过当天
然底物经历由野生型酶催化的化学转化时鉴定所述天然底物的一个或更
多个位姿、所述天然底物的反应中间体、或所述天然底物的过渡态来鉴定
所述底物经历催化的化学转化的限制。
18.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述限制包括以下
的一个或更多个：位置、距离、角度和扭转限制。
19.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述限制包括所述
底物上的特定部分和所述活性位点中的特定残基或残基部分之间的距离。
20.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述限制包括所述
底物上的特定部分和辅因子上的特定残基或残基部分之间的距离。
21.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述限制包括所述
底物上的特定部分和所述活性位点中的理想地定位的天然底物之间的距
离。
22.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括将一个或
更多个酶限制的组应用于所述多个酶变体，其中，所述一个或更多个酶限
制与当天然底物在野生型酶的存在下经历催化的化学转化时所述野生型
酶的限制相似。
23.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述底物的所述多
个位姿通过选自由以下组成的组中的一个或更多个对接操作来获得：高温
分子动力学、随机旋转、通过基于网格的模拟退火的改进、基于网格的最
小化或全力场最小化及其任何组合。
24.如前述权利要求中任...

【专利技术属性】
技术研发人员：张希云，拉塞尔·贾维尼亚·萨米恩托，唐纳德·斯科特·巴斯克维尔，耶伊特·W·胡伊斯曼，
申请(专利权)人：科德克希思公司，
类型：发明
国别省市：美国;US