【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及乳腺癌预后预测因子领域，尤其涉及定量检测乳腺癌患者瘤内异质性的方法，具体的说，是一种用于检测三阴性乳腺癌瘤内异质性的方法。
技术介绍
乳腺癌是常见恶性肿瘤之一。根据WHO最新统计数据，我国每年新发女性乳腺癌患者约18万，位居女性恶性肿瘤发病率第二，其治疗和预后预测受到大家的广泛关注。乳腺癌是一种异质性很高的疾病，其预后与不同亚型（ER、PR、HER-2受体状态）、肿瘤分期、增殖指数（Ki-67）、组织学分级等因素密切相关。然而在以上因素一致的情况下，尤其对于ER、PR、HER-2均为阴性的三阴性乳腺癌（TNBC）这一预后最差的乳腺癌亚型，不同患者间的预后仍存在差异。因此人们在不断探索新的、有效的预后预测指标，以准确判断患者复发和转移风险，及时调整治疗策略。除了不同亚型的乳腺癌治疗和预后存在差异，肿瘤内部也具有很高的异质性，且有研究表明，肿瘤的瘤内异质性与疾病的诊断、治疗和预后密切相关。例如，同一患者不同部位的肿瘤组织荧光原位杂交检测HER-2扩增结果可能不一致，这有可能会影响临床检测的结果和治疗方案的制定。因...
【技术保护点】
一种用于检测三阴性乳腺癌瘤内异质性的方法，其特征是：包括以下步骤：步骤一、三阴性乳腺癌瘤内异质性检测芯片的制作：1)制作受体蜡块：在石蜡包埋机下，用模具制备受体蜡块；采用组织取样针在受体蜡块上打孔，相邻孔芯之间具有一定间隙，使孔芯在受体蜡块上形成微阵列；2)供体蜡块取材：收集数组所需检测的三阴性乳腺癌组织及配对正常组织石蜡标本作为供体蜡块；每组供体蜡块制切片后均进行H&E染色，观察组织结构典型的乳腺癌区，并在玻片上圈出，对照H&E染色切片，在供体蜡块相应部位上作出标记；在组织芯片制作仪上用同一直径的取样针对供体蜡块标记部位进行取样，一组取数个不同位置的癌组织...
【技术特征摘要】
1.一种用于检测三阴性乳腺癌瘤内异质性的方法，其特征是：包括以下步骤：
步骤一、三阴性乳腺癌瘤内异质性检测芯片的制作：
1)制作受体蜡块：
在石蜡包埋机下，用模具制备受体蜡块；采用组织取样针在受体蜡块上打孔，相邻孔芯之间具有一定间隙，使孔芯在受体蜡块上形成微阵列；
2)供体蜡块取材：
收集数组所需检测的三阴性乳腺癌组织及配对正常组织石蜡标本作为供体蜡块；每组供体蜡块制切片后均进行H&E染色，观察组织结构典型的乳腺癌区，并在玻片上圈出，对照H&E染色切片，在供体蜡块相应部位上作出标记；在组织芯片制作仪上用同一直径的取样针对供体蜡块标记部位进行取样，一组取数个不同位置的癌组织和一个正常对照组织的组织芯；
瘤内异质性组织芯片制作：
将每组供体蜡块上取得的组织芯按一定排布规律，垂直塞入受体蜡块对应位置的空白孔芯中；将做好的组织芯片放回蜡块模中，加热至半熔后，将组织芯片冷却，再加热至半熔，重复数次，使组织芯与受体蜡块紧密结合；然后将组织芯片表面修平；将组织芯片切片并进行H&E染色，再次确认取材点是否与供体蜡块标记的目标区域相同；
步骤二、多探针联合荧光原位杂交：
探针选择：采用两个双色探针和一个单色探针进行三阴性乳腺癌瘤内异质性的检测；每个探针单独进行荧光原位杂交，步骤相同，具体如下：
切片预处理：将制作好的组织芯片切片，将切好的白片保温，过夜；次日室温二甲苯中脱蜡，再对切片浸洗处理，自然晾干玻片；
b、变性杂交：避光下滴加探针覆盖切片目标区域，加盖盖玻片并用树脂胶封边，放入杂交仪过夜；
c、洗涤复染：避光下取出玻片，揭去封胶，室温浸于SSC液中使盖玻片自然脱落，对玻片浸洗处理，自然晾干玻片，滴加DAPI封片，放置15min后于荧光显微镜下观察并拍照；
步骤三、计算瘤内异质性
1)每个点计数多个轮廓清晰、与周围细胞没有重叠、荧光信号清晰的细胞，记录下每个细胞内部红色信号和绿色信号的个数，每个细胞可计算其拷贝比值；
2)将每组细胞的信息进行汇总，计算每组的瘤内异质性指数，具体公式为：
H’=-∑piln(pi),
其中pi代表第i个拷贝值的细胞在所有细胞中所占的比例；每组将三个探针的H’求和得出总的瘤内异质性指数H。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测三阴性乳腺癌瘤内异质性的方法，其特征是：步骤一中制作的受体蜡块用于制备尺寸为25.0mm×23.8mm×5.0mm的组织芯片，组织取样针直径为1.0mm，组织取样针在受体蜡...
【专利技术属性】
技术研发人员：管晓翔，杨芳，李权，张文文，
申请(专利权)人：管晓翔，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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