森林山蛭镇痛肽mh2620及其基因和应用制造技术

本发明专利技术涉及一种森林山蛭(Haemadipsa sylvestris)镇痛肽mh2620及其基因和应用，属于生物医学技术领域。镇痛肽mh2620及其基因和应用，属于生物医学技术领域。森林山蛭镇痛肽mh2620是森林山蛭镇痛肽基因编码的一种单链多肽，分子量2620.13道尔顿，等电点5.26。森林山蛭镇痛肽mh2620由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成。编码森林山蛭镇痛肽mh2620的基因，由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列组成。本发明专利技术所述的森林山蛭镇痛肽mh2620在制备钠离子通道抑制剂和镇痛药物中的应用。本发明专利技术的有益效果在于:森林山蛭镇痛肽mh2620能够抑制钠离子通道，有极显著的镇痛作用；该镇痛肽具有结构简单、人工合成方便、镇痛活性强，能作为制备钠离子通道抑制剂和制备镇痛药物的应用。

【技术实现步骤摘要】

：本专利技术提供一种森林山蛭(Haemadipsasylvestris)镇痛肽mh2620及其基因和应用，属于生物医学

技术介绍
：蛭类是我国的一种传统中药，两千多年前的《神农本草经》中就有描述。《本草纲目》谓其：“咸走血，苦胜血。水蛭之咸苦，以除蓄血，乃肝经血分药，故能通肝经聚血。”中医认为水蛭是一种传统的破血药，有逐瘀、通经脉、利水道的功效，主要用于治疗血瘀经闭、中风偏瘫、跌打损伤等疾病。森林山蛭(Haemadipsasylvestris)，又称草蛭。蛭纲,水蛭科。体略呈长椭圆形,长约3厘米。该物种的模式产地在缅甸长林山。分布于印度尼西亚、缅甸、印度、越南以及中国大陆的云南等地。主要栖息于潮湿的山区草地或竹林里以及水附近或水中。当人畜经过时，就附着吸食血液。山蛭能分泌抗凝血的物质，破坏凝血功能。因此被山蛭咬过的伤口常流血不止，且极少感到疼痛。民间也利用这一性质，用山蛭来治疗病人的局部血流不畅。但是人们对这些治疗作用的物质基础和分子机制还了解很少，特别是为什么山蛭叮咬时不会感觉疼痛？目前除了水蛭素和一些几个蛋白酶抑制剂外，蛭类中的其它生理功能的活性成分，例如抗炎、镇痛成分，特别是多肽类成分的研究还很少。而对山蛭的研究更是鲜有报导。蛭类疗法有很长的历史，在公元前1500年的埃及法老陵墓中就有使用蛭类治疗的图画。2005年，欧洲正式批准蛭类疗法为合法的治疗手段[8]。每年仅在德国就有35万条水蛭用于医疗。很多文献都报导了蛭类疗法的镇痛作用，长期的临床实践也证明蛭类疗法对多种疼痛具有很好的疗效。蛭类疗法可以缓解风湿性关节炎的疼痛，并改善运动功能[9]；慢性上髁炎会产生持续疼痛，并影响运动功能，很多疗法对其无效。在40个病人的临床研究中发现，运用蛭类治疗7天，多数病人的疼痛能够得到缓解。除了少数病人皮肤发痒外，没有其它的副作用；蛭类疗法也运用于多种背痛综合征。肌肉疼痛和肌肉硬化是多种背痛综合征的症状。通过蛭类疗法，背疼症状能够很快缓解；在包括运动损伤等多种血肿性疼痛中，蛭类疗法也得到了广泛的运用。有一些研究证明，蛭类疗法对静脉炎等血管性疼痛也具有很好的疗效；还有报导显示，口服水蛭能够完全缓解肾细胞瘤和平滑肌瘤引起的腰椎疼痛。虽然蛭类镇痛临床运用广泛，但是对其作用的物质基础的结构功能的研究却未见任何报导。人们通常感觉不到山蛭的叮咬，只是发现山蛭叮咬后伤口流血不止。在长期的临床实践中，人们也发现蛭类具有镇痛功能，并运用于多种类型的疼痛治疗。但是对其活性成分和作用机制却一无所知。目前，研究较多的和镇痛相关的钠离子通道主要为Nav1.3、Nav1.7、Nav1.8和Nav1.9。Nav1.3通道在DRG细胞中表达，在成年初级感觉传入神经元中表达量很低。当神经或脊柱受到损伤时，Nav1.3通道表达大大增加，证明该通道在神经性疼痛产生中的重要作用。Nav1.7通道大量表达于初级感觉神经元和交感神经节神经元。Nav1.7通道与炎性疼痛具有关系密切。Nav1.8专一表达于外周神感觉经元，主要分布于伤害性感觉神经元。已有研究表明Nav1.8在炎性疼痛和神经性疼痛中均具有重要作用。Nav1.9通道主要表达于DRG、三叉神经节的伤害感受神经元和肠肌层神经元，实验证明Nav1.9在炎性疼痛中起到重要作用。本专利技术涉及的多肽mh2620能够抑制大鼠DRG神经元钠离子通道。通过动物模型证实它具有很强的镇痛活性。专利技术人将本专利技术的森林山蛭镇痛肽mh2620全序列氨基酸结构经蛋白质数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同多肽。专利技术人将本专利技术的森林山蛭镇痛肽mh2620编码基因经基因数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同基因。
技术实现思路
：本专利技术的目的是基于上述理论研究和现有技术基础，提供一种新的具有强烈的镇痛活性的森林山蛭mh2620肽及其基因和应用。为了实现本专利技术的目的，本专利技术提供了如下技术方案：森林山蛭镇痛肽mh2620是森林山蛭镇痛肽基因编码的一种单链多肽，分子量2620.1道尔顿，森林山蛭镇痛肽mh2620的氨基酸序列(SEQIDNO:1)为：N-丙氨酸-半胱氨酸-赖氨酸-谷氨酸-酪氨酸-色氨酸-谷氨酸-半胱氨酸-甘氨酸-丙氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-半胱氨酸-异亮氨酸-谷氨酸-甘氨酸-异亮氨酸-半胱氨酸-缬氨酸-脯氨酸-甲硫氨酸-异亮氨酸(ACKEYWECGAFLFCIEGICVPMI)。森林山蛭镇痛肽基因的克隆包括:森林山蛭唾液腺总RNA提取，mRNA纯化，mRNA反转录及cDNA文库构建，设计引物，利用PCR方法筛选森林山蛭镇痛肽基因。扩增引物长度为27个核苷酸，其序列为5’CATNGGNACGCAAATGCCTTCGATGCA3’，PCR另一扩增引物为3’PCRPrimer引物，其序列为5’TACTGGGAATGCGGTGCCTTCTTG3’。所获阳性单克隆进行基因核苷酸序列测定。基因测序结果表明编码森林山蛭镇痛肽的由447个核苷酸组成，自5’端至3’端序列(核苷酸序列SEQIDNO:2)为:AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAGCATTACGGCCGGGGAGTCATCAGTGAAGATGAGAACTCTCTTGGTATTCCTGTTGCTTGCAATCTTTGTTGCCGTTTTAATCGGCAATGTTCAAGTCGAAGCTGCTTGCAAAGAATACTGGGAATGCGGTGCCTTCTTGTTTTGCATCGAAGGCATTTGCGTGCCAATGATTGGATGAACCTCTAAAAATTTCAATGTTTCTTGCATTGGAAAAACTTCCCTTCCCATTTTGATCATTTAATTAAATGAAAATTGTTCTTGCATTGGCAGATATTCCTCCATCATTTAAATTTTGCAAGATTATCCATTATATGATATTGAAAACTCAAATTTAAAATTATTATAATAAATACAATTAAGTTATTAAATTCTTCAAAAAAATATGTGAAATTACTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA其中128-200的片段编码森林山蛭镇痛肽成熟肽。森林山蛭镇痛肽基因作为基因工程制备森林山蛭镇痛肽的应用。森林山蛭的分离纯化方法：收集的森林山蛭唾液腺分泌液首先过凝胶层析柱SephadexG-50，收集具有镇痛活性的峰，冻干，过反向高液相(RP-HPLC)C18柱，纯化得到森林山蛭镇痛肽。森林山蛭镇痛肽的化学合成方法：根据Edman降解法测得序列和编码森林山蛭镇痛肽肽基因推断的氨基酸序列，用本文档来自技高网...

【技术保护点】
森林山蛭镇痛肽mh2620，其特征在于由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成。

【技术特征摘要】
2016.03.03 CN 20161012041091.森林山蛭镇痛肽mh2620，其特征在于由SEQIDNO:1所示的氨基酸序列组成。
2.编码森林山蛭镇痛肽mh2620的...

【专利技术属性】
技术研发人员：赖仞，龙承波，吕秋敏，容明强，
申请(专利权)人：中国科学院昆明动物研究所，
类型：发明
国别省市：云南;53