本发明专利技术属于纳米材料与检测技术领域，具体为一种基于花粉为模板的钛‑锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料的合成方法及其应用。本发明专利技术利用一锅法合成包聚有钛‑锆双金属氧化物的花粉粒子，在高温下煅烧后形成以花粉粒子为模板的双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料。该材料具有大的比表面积，强亲水性和较好的生物相容性，煅烧除去模板花粉的同时发生了钛‑锆双金属原子水平掺杂形成双金属氧化物，使得复合材料能够与含有负电荷的磷酸根的磷酸化肽段更好的发生配位作用，从而实现对低丰度磷酸化肽混合样品的高效分离富集。本发明专利技术新颖简便，成本低廉，实用高效，重复性好，稳定性高，具有广阔宽的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于先进纳米材料与检测
，具体涉及一种。技术背景随着人类基因组测序计划的完成，对蛋白质组学的研究已成为生命科学领域研究的重点。蛋白的可逆磷酸化是生物细胞内最普遍的一种蛋白的翻译后修饰，在细胞发育、新陈代谢、疾病监控、信号传导、酶活性调控、基因表达等生命过程中起着不可替代的作用。目前，生物质谱技术被广泛应用于蛋白翻译后修饰分析中，但由于磷酸化蛋白/肽段的低丰度和较低的电离效率，以及磷酸化肽的质谱信号往往被非磷酸化肽所抑制，导致直接用质谱进行分析检测将会面临巨大挑战。因此对于复杂生物样品中的磷酸化蛋白/肽段在质谱分析前进行选择性分离、富集，是成功鉴定磷酸化蛋白/肽段的重要过程。近年来，多种方法策略被开发用来选择性分离富集磷酸化蛋白/肽段，其中金属氧化物亲和色谱方法(MOAC)成为研究的热点，MOAC方法相比于其它方法显示出诸多优越性，例如:快速富集、操作简便、成本低廉的特性。其中二氧化钛和二氧化锆都是对于磷酸化蛋白/肽段高效分离、富集的金属氧化物，但将钛-锆两种氧化物进行混合，不仅仅是发生物理混合，而是在材料合成过程中发生了原子层面掺杂，形式新型的双金属氧化物，能够更好地发挥其在磷酸化蛋白/肽段高效分离、富集的协同作用。花粉做为一种自然界中广泛存在天然产物，由于其独特的生物结构，表面含有大量固有官能团，高比表面积以及良好的生物兼容性，被广泛应用于诸多领域。结合花粉颗粒这一独特结构，本专利技术设计了一种基于花粉为模板的钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料，合成方法简单新颖。以花粉颗粒为模板，外面包裹形成钛-锆双金属氧化物，在高温煅烧下，除去花粉模板的同时，钛-锆双金属原子发生水平掺杂，形成了蜂窝状介孔复合材料。该合成材料对于低丰度磷酸化蛋白/肽段的鉴定达到了令人满意的结果。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种合成成本低、稳定性好、重复率高的钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料及其合成方法，以及其在磷酸化肽分离、富集与MALD1-T0F-MS检测中的应用。本专利技术提供的钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料的合成方法，是基于花粉为模板的，具体步骤如下: (I)花粉样品的处理:将氯仿和甲醇溶液按照1:(3-4)体积比均匀混合;将研磨后的花粉颗粒(PGs)浸泡在上述混合溶液中，过夜;过滤除去混合溶液后，将花粉颗粒在80-100°C的甲醇溶液中加热回流24-30小时;冷却后离心分离，并用去离子水充分洗涤，40-60 °C下真空干燥； (2)将步骤(I)所得产物PGs分散在异丙醇溶液中，超声0.5-1.0小时； (3)将异丙醇钛、异丙醇锆和二乙胺加入到步骤(2)所得混合溶液中，充分搅拌0.5-1.0小时； (4)将步骤(3)所得混合溶液转移至水热反应釜中，在180-220°C下加热22-24小时； (5)将步骤(4)中高压反应釜冷却至室温，所得产物经过离心分离，并用去离子水和无水乙醇洗涤以除去多余的原料，40-60°C下真空干燥； (6)将步骤(5)所得产物在600-800°C下高温煅烧2-3小时，即得到钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料，记为PGs@(T1-Zr)04。本专利技术中，步骤(I)中氯仿和甲醇溶液的体积比优选为:1:3.5。本专利技术中，步骤(2)中PGs的用量为70-75mg，异丙醇溶液体积为85-90mL。本专利技术中，步骤(3)中异丙醇钛、异丙醇锆和二乙胺的比例为(1.5-2.0mL): (1.Ο-Ι.5g):(0.04-0.05mL)。本专利技术中，步骤(5)中高温煅烧温度优选600-700°C。本专利技术制备的基于花粉为模板的钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料可用于磷酸化肽分离、富集与质谱鉴定中，具体操作如下:将产物基于花粉为模板的钛_锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料与目标磷酸化肽溶液充分混合，加入40-60%乙腈/0.05-0.15%三氟乙酸缓冲液中，分散均匀，在37-38°C酶解仪中孵育;通过离心分离出复合材料，用40-60%乙腈/0.05-0.15%三氟乙酸缓冲液洗涤复合材料3-4次，用0.3-0.5M氨水洗脱;取0.8-1.5yL洗脱液点在MALD1-TOF-MS靶板上，自然干燥后再滴加0.8-1.5yL浓度为15-25 mg/mL的2,5-二轻基苯甲酸(DHB)溶液于被分析物液滴上，形成薄层基质，干燥后进行质谱分析。将原本得不到磷酸化肽段鉴定信号的蛋白酶解液，利用该合成的复合材料进行富集后进行质谱检测，可以得到清晰、信噪比高的磷酸化肽段信号峰，该富集策略已经实践于β-casein蛋白酶解液、β-casein与牛血清白蛋白混合溶液酶解液、正常人血清、脱脂牛奶酶解液和小鼠鼠肝等多项实验中。本专利技术的有益效果在于:所提供的花粉为模板的钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料的合成方法简单，制备所得复合材料具有良好的亲水性孔道结构、优异的生物相容性和大比表面积，对磷酸化肽的富集具有很强的选择性和卓越的灵敏度，可作为一种有效的固相微萃取材料应用于磷酸化肽的富集分离。该材料设计结合以花粉颗粒这一独特结构为模板，外面包裹形成钛-锆双金属氧化物，在高温煅烧下，除去花粉模板的同时，钛-锆双金属原子发生水平掺杂，形成了蜂窝状介孔复合材料。该合成材料对于低丰度磷酸化蛋白/肽段的鉴定达到了令人满意的结果。实验结果充分证明，本专利技术制得的复合材料合成成本低、稳定性好、重复率高，适用于各种复杂生物样品中，在大规模分析磷酸化肽样品中具有广阔的应用前景。【附图说明】图1为基于花粉为模板的钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料的合成流程图。图2为实施例1的基于花粉为模板的钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料的透射电子显微镜(a)和能量谱图(b)照片。图3为实施例1的基于花粉为模板的钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料的元素分析谱图。图4为实施例2中100nM的β-casein酶解液(a)和(b)经基于花粉为模板的钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料选择性富集后的质谱图。图5为实施例3中质量比为1:1500的β-casein和BSA蛋白酶解混合溶液(a)选择性富集前和(b)经基于花粉为模板的钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料选择性富集后的质谱图。图6为实施例4中质量比为I: 1000: 1000的β-casein蛋白酶解液、a-casein蛋白和BSA蛋白混合溶液(a)、(b)选择性富集前和(c)、(d)经基于花粉为模板的钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料选择性富集前的质谱图。图7为实施例5中0.1fmolAxL的β-casein酶解液(a)选择性富集前和(b)经基于花粉为模板的钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料选择性富集后的质谱图。图8为实施例6中正常男性/女性(同岁)血清溶液中的肽段(a)和(b)经基于花粉为模板的钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料选择性富集后的质谱图。图9为实施例7中脱脂牛奶溶液中的肽段(a)和(b)经基于花粉为模板的钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料选择性富集后的质谱图。【具体实施方式】实施例1:一种基于花粉为模板的钛-锆双金属原子水平掺杂本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于花粉为模板的钛‑锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料的合成方法，其特征在于具体步骤如下：（1）花粉样品的处理：将氯仿和甲醇溶液按照1:（3‑4）体积比均匀混合；将研磨后的花粉颗粒（PGs）浸泡在上述混合溶液中，过夜；过滤除去混合溶液后，将花粉颗粒在80‑100℃的甲醇溶液中加热回流24‑30小时；冷却后离心分离，并用去离子水充分洗涤，40‑60℃下真空干燥；（2）将步骤（1）所得产物PGs分散在异丙醇溶液中，超声0.5‑1.0小时；（3）将异丙醇钛、异丙醇锆和二乙胺加入到步骤（2）所得混合溶液中，充分搅拌0.5‑1.0小时；（4）将步骤（3）所得混合溶液转移至水热反应釜中，在180‑220℃下加热22‑24小时；（5）将步骤（4）中高压反应釜冷却至室温，所得产物经过离心分离，并用去离子水和无水乙醇洗涤以除去多余的原料，40‑60℃下真空干燥；（6）将步骤（5）所得产物在600‑800℃下高温煅烧2‑3小时，即得到钛‑锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料，记为PGs@(Ti‑Zr)O4。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：高明霞，张祥民，王嘉希，李杰，王亚楠，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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