本发明专利技术提供一种表达重组蛋白G的细菌磁颗粒，该表达重组蛋白G的细菌磁颗粒是对趋磁细菌MSR-1重组株进行扩大培养、分离纯化得到的，并且还提供了表达重组蛋白G的细菌磁颗粒在用于血型不规则抗体IgG的检测中的应用；本发明专利技术提供的表达重组蛋白G的细菌磁颗粒利用细菌磁颗粒的磁特性，在外加磁场的作用下可以帮助致敏红细胞凝集，一方面最大限度减少细菌磁颗粒的使用量，另一方面最大限度提高低效价IgG抗体的检测敏感性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及纳米磁珠应用和医学检测领域，具体是涉及表达重组蛋白G的细菌磁 颗粒及其应用。
技术介绍
细菌磁颗粒是趋磁细菌生产的一种磁性纳米颗粒，内核是Fe304晶体，外面有一层 磷脂生物膜包被，粒径在30-120nm之间。同一种趋磁细菌生产的细菌磁颗粒粒径大小和晶 体晶型基本一致，磁学性质均一，有天然生物膜包被，具有很好的水溶性质和胶体性质。此 外，因为细菌磁颗粒是生物来源，因此具有较好的生物相容性。细菌磁颗粒膜上带有大量的 氨基基团，可通过化学修饰和双功能偶联剂连接不同的功能大分子，如抗体，从而具有不同 的独特功能。 细菌磁颗粒最独特的地方在于它可以通过基因工程的方法在细菌磁颗粒膜上表 达特殊的蛋白质，通过和细菌磁颗粒膜上锚定蛋白的融合表达，功能性的靶蛋白可以在细 菌磁颗粒上展示出来。相比化学修饰的方法，这种生物学功能修饰的好处和优势更加显而 易见。因此，细菌磁颗粒作为一种新型的微生物来源纳米磁珠材料，在生物医学和纳米材料 领域具有广泛的应用前景。 链球菌蛋白G(Streptococcus Protein G，SPG)是在A、C和G群链球菌的细胞壁上 发现的一种能够和人及多种哺乳动物的IgG相结合的蛋白质，它同IgG的亲和力强，结合谱 广，在免疫学和免疫化学上有着广泛的应用。重组的蛋白G去除了天然的蛋白G与其他诸如 白蛋白、Fab抗体段结合的位点，可特异性结合IgG抗体的Fc区段。 抗人球蛋白试验，又称为Coombs试验(库姆试验），是检测血型不规则抗体IgG的重 要依据。血型抗体有IgG和IgM两类，其中的IgM抗体在盐水介质中能与含相应抗原的红细胞 发生肉眼可见的凝集反应。而IgG抗体只能致敏红细胞，不能使其凝集，因此需要通过抗人 球蛋白抗体作为第二抗体，将致敏红细胞表面的IgG连接起来才能使得红细胞发生凝集。在 自动化检测中，抗人球蛋白试验需要结合微柱凝胶卡来使用，随着微柱凝胶卡的成本越来 越高，一定程度上增加了常规试验和血型抗体筛查中抗人球试验的成本。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种表达重组蛋白G的细菌磁颗粒及其应用。 本专利技术利用重组蛋白G作为第二抗体，替代抗人球试验中的抗人球抗体试剂;利用细菌磁颗 粒的磁特性，在外加磁场的作用下可以帮助致敏红细胞凝集，一方面最大限度减少细菌磁 颗粒的使用量，另一方面最大限度提高低效价IgG抗体的检测敏感性。 本专利技术具体技术方案如下： 本专利技术一方面提供了表达重组蛋白G的细菌磁颗粒在用于血型不规则抗体IgG的 检测中的应用。 本专利技术另一方面提供一种表达重组蛋白G的细菌磁颗粒，该表达重组蛋白G的细菌 磁颗粒是对趋磁细菌MSR-1重组株进行扩大培养、分离纯化得到的。 进一步的改进，该重组蛋白G的序列是： 进一步的改进，本专利技术提供述趋磁细菌MSR-1重组株是通过如下方法构建而成的： a.构建细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株； b.构建细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒； c.将功能化细菌磁颗粒融合表达质粒通过接合转入到步骤8制得的趋磁细菌MSR-1突变株，构建趋磁细菌MSR-1重组株。 本专利技术另一方面提供一种表达重组蛋白G的细菌磁颗粒的制备方法，该方法包括 如下步骤： a ·构建细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株； b.构建功能化细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒； c.将功能化细菌磁颗粒融合表达质粒通过接合转入到步骤a制得的趋磁细菌MSR-1突变株，构建趋磁细菌MSR-1重组株； d ·对趋磁细菌MSR-1重组株进行培养； e .分离纯化，制得功能化细菌磁颗粒。进一步的改进，步骤a所述构建细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因缺失的趋磁细菌 MSR-1突变株的具体方法为： (a)扩增细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因左右两侧共两个长均为700_1000bp的 同源片段;左右两同源片段均带有两个酶切位点； (b)左右同源片段分别用相应的限制性内切酶进行双酶切；同时对自杀质粒 pKmobsacB进行双酶切； (c)将经过双酶切后的左右同源片段和经过双酶切后的自杀质粒pKmobsacB进行 连接，连接产物转到E.coli感受态细胞中，挑选连接正确的阳性克隆菌； (d)将阳性克隆菌作为供体与趋磁细菌MSR-1受体菌进行亲本接合，并导入 pKmobsacB重组质粒，通过卡那抗性筛选趋磁细菌MSR-1同源整合突变株，突变株再通过蔗 糖梯度筛选趋磁细菌MSR-1双交换突变株，最后选择卡那抗性敏感的双交换菌株进行验证， 构建成细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株；步骤b所述细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒的构建方法如下： (1)扩增细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因跨膜结构域的DNA片段，所述DNA片段两 端分别带有双酶切位点；对扩增产物DNA片段及pBBR质粒进行双酶切，回收双酶切的DNA片 段及双酶切的PBBR质粒;将双酶切的DNA片段与双酶切的pBBR质粒进行连接，连接产物转化 大肠杆菌感受态细胞中，筛选连接正确的阳性克隆，得到重组质粒PBBR-细菌磁颗粒膜蛋白 mamC/mamF基因； (2)重组蛋白G的编码序列克隆在pUC57载体上，在两端分别加上双酶切位点，制得 重组蛋白G质粒； (3)对步骤(2)基因合成得到的重组蛋白G质粒进行扩增和双酶切； (4)对步骤（1)得到的重组质粒pBBR-细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因进行双酶 切并纯化，和步骤(3)得到的经过双酶切的重组蛋白G质粒的基因片段进行连接，连接产物 转化大肠感觉感受态细胞中，筛选并验证连接正确的阳性克隆，最终得到细菌磁颗粒膜蛋 白融合表达质粒pBBR-细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因-重组蛋白G;步骤c所述的具体方法为： I以细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒pBBR-细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因-重 组蛋白G作为供体，通过亲本接合实验将其导入到细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因缺失的 趋磁细菌MSR-1突变株，构建生产功能化细菌磁颗粒的趋磁细菌MSR-1重组株。进一步的改进，所述步骤d中对趋磁细菌MSR-1重组株进行培养包括如下步骤： d-a.向培养罐中加入第一培养基，加热灭菌15_20min，加热温度为110-120°C，将 趋磁细菌MSR-1重组株接种到培养罐中，无氧状态进行第一次培养，获得第一培养液;第一 次培养的条件为:起始pH值为5.3-5.5，培养温度为28-30 °C，培养时间为1-2天，摇床转速为 250-280转/分钟； d-b.将第一培养液加入含有第二培养基的培养罐中，进行第二次培养;第二次培 养的条件为:起始pH值为6.2-6.3，培养温度为20-22°C，培养时间为5-8天，摇床转速为150-180转/分钟，培养过程中通入氧气，通入氧气的方式为：间隔5min，通入20min氧气，间隔 5min，通入lOmin空气，循环5次。进一步的改进，所述第一培养基由重量份数为0.2-0.3份甘油酸三乙酯、1.5-3份 多聚谷氨酸、0.2-0.3份磷酸吡哆醛、0.5-1份硝酸铵、0.02-0.05份维生素 C、10-12份葡萄糖 酸本文档来自技高网...
【技术保护点】
表达重组蛋白G的细菌磁颗粒在用于血型不规则抗体IgG的检测中的应用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张金菊，王红光，
申请(专利权)人：北京中科圆融生物科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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