一种快速从抗辐射菌中提取总RNA的方法技术

本发明专利技术涉及一种快速从抗辐射菌中提取总ＲＮＡ的方法，该方法包括以下步聚：１）材料：指数生长期的抗辐射菌Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ　ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ；２）提取总ＲＮＡ：裂解：加入５００μＬ细胞裂解液，涡旋混匀；加入１２０－２００μＬ　５０ｍｇ／ｍＬ溶菌酶，５０℃保温１５分钟；抽提：加入１ｍＬ　Ｅｚｏｌ，室温裂解１５分钟；加入２００μＬ氯仿，离心，取上清，然后加入１．５－２．５倍的异丙醇沉淀；样品的清洗和保存：清洗ＲＮＡ样品后加入ＤＥＰＣ水溶解，在－８０℃下保存；３）ＲＮＡ质量的检检测：根据所得数据和电泳结果，表明所得总ＲＮＡ的纯度高、产率高、完整性好。本发明专利技术有益的效果：本发明专利技术实验过程快速、简洁、重复性好。该方法也适合于细胞壁结构复杂的细菌的总ＲＮＡ的提取。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
中提取RNA的方法，主要是一种快速从抗辐射菌中提取总RNA的方法，适用 于此类细胞壁结构复杂的细菌的总RNA的提取。
技术介绍
抗辐射菌"ey/wcocc^ ^^2'o^^朋s是一种革兰氏阴性的非孢子菌，对电离辐射、干燥、紫外线、强 氧化剂和一些化学诱变剂有着极强的抗性。自从抗辐射菌被发现以来，就受到生物、医学和环境工程等领 域的极大关注，纷纷从基因组学、蛋白组学水平对其进行研究。当前对小分子RNA的研究是生物学界的一 项热点，要从这方面研究抗辐射菌Zfe/'"ococciW raA'ofl^i^/ ^,如何提取高质量的总RNA是关键。当前提取组织样本中的总RNA (核糖核酸)的基本方法主要有Trizol (RNA提取试剂)试剂盒、SDS (十二烷基硫酸钠)法、异硫氰酸胍法、CTAB (十六垸基三甲基溴化铵)法、苯酚法等。要提取组织样品中的总RNA,如何充分裂解组织样品的细胞壁是关键。对于动植物组织样本， 一般采取液氮研磨的方式来帮助裂解组织；而对于一般的细胞和细菌样本，则采用直接加入Trizol等RNA提取剂提取。抗辐射菌"w7wcocc"s ra^oo^r朋s的细胞壁可以划分为14-20 nm的肽聚糖层和一个未知的分层结 构，在电镜观察下，其结构至少可以分成六层。最初，人们认为抗辐射菌Zte化ococcMrsA'o^yra/^是革 兰氏阳性菌，这是由于其细胞壁的肽聚糖层太厚且在革兰氏染色后难以脱色，显革兰氏阳性反应，实际上 它的细胞壁成分和一般革兰氏阴性菌相似。抗辐射菌Zte&ococcwsra&'o^/rs/^的脂肪酸组成也与众不同， 它既不含羟基脂肪酸、类脂以及庚糖、也不含有多不饱和脂肪酸、环丙基和分支脂肪酸，而是含有一个由 15-、 16-、 17-以及18-碳饱和或单不饱和脂肪酸组成的混合物。这些就决定了按照一般的细菌的总KNA的 提取方法是无法提取抗辐射菌Zfei/70coccws ra力'ofl^ra/w中的总RNA。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述技术的缺陷，而提供一种快速从抗辐射菌中提取总RNA的方法， 一种能快速从抗辐射菌Zfei"ococcM ra力'o^/ra/w中提取能满足下游分子生物学实验的高质量的总RNA的方法，整个实验过程快速便捷，提取的总RNA质量高，实验结果重复性好。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的。这种快速从抗辐射菌中提取总RNA的方法，包括以下步骤1) 、材料指数生长期的抗辐射菌"e&ococcM ra力'ooto"朋s;2) 、提取总RNA:裂解加入500叱细胞裂解液(PH7-8)，涡旋混匀；加入12(3-200叫5P mg/mL溶菌酶，5(TC保温15分钟。抽提加入lmL Ezol (上海吉玛制药技术有限公司出品的一种RNA提取液)，室温裂解15分钟；加入 200 A氯仿，离心，取上清，然后加入1.5-2.5倍的异丙醇沉淀。样品的清洗和保存清洗RNA样品后加入DEPC水溶解，在-8CTC下保存。 3)、 RNA质量的检测通过NanoDrop ND-1000分光光度计(美国NanoDrop科技有限公司)和甲醛琼脂糖变性胶检测提取的总 RNA的纯度、得率和完整性。在步聚2)中，加入的裂解液的pH为7.5，用量是500-1000 y L/ mL菌液。在步聚2)中，加入的溶 菌酶的最终浓度是0.95 mg/inL。在步聚2)中，加入的异丙醇的体积是上清液体积的2倍。本专利技术的有益效果本技术通过加入细胞裂解液和溶菌酶，使抗辐射菌Ztei"ococc^ ra力'o&ra/:s的 细胞壁得到了充分裂解，使在提取抗辐射菌Zte/"ococcf/s ra力'o&ra/w总RNA的过程中免除了使用研钵研 磨的过程，简化了实验过程，縮短操作时间，同时也避免了在研磨过程中发生的污染、氧化和总RNA的损 失。该方法同时还适合细胞壁厚、成分复杂的细菌总RNA的提取。 附图说明图1是本专利技术提取的抗辐射菌中总RNA的电泳图2是本专利技术提取总RNA后取RT PCR (反转录聚合酶链式反应)后的产物的电泳图； 其中，图1上的2个样品是重复；图2中1: 16SrRNA (16S核糖体核糖核酸)；2: SAM riboswitch(S-甲腺甲硫氨酸核开关)；3: PyrococcusC/D box small nucleolar RNA (Pyrococcus C/D方块小核仁RNA)。具体实施例方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图及具体实施例对本专利技术作进一步地详细 描述这种快速从抗辐射齒Z^7 ococc^ ra必o^/r朋s中提取总RNA的方法，包括以下步骤1、取k)L指数生长期的抗辐射菌液入2 niL离心管，室温下4,000rpm离心4分钟，去上清。力口500 ML细胞裂解液，充分混匀，使菌悬浮在裂解液中，然后加入120-200 PL 50 mg/inL溶菌酶，振荡混匀，50'C保温15分钟；注意上清要尽量去干净，细胞裂解液(pH7-8)的配方是10 mM Tris-HCl (pH7. 5)(三羟甲基 氨基甲垸-盐酸缓冲液)，10 mM EDTA (pH8. 0)(乙二胺四乙酸)，0.5% (g/v) SDS。溶菌酶的最终浓度 是0. 95-1. 5 mg/mL。2、 加入lmL Ezol，室温放置15分钟。在丄.5 mL离心管中加入20Q "I氯仿，充分混匀，4'C, 12， OOOX g,离心15分钟；3、 取上清，加到一个新的EP管中，加入l mL异丙醇，充分混匀，-20 'C沉淀过夜；注意异丙醇的最佳用量是取上清液的1.5-2.5倍。如果实验最终需要的是威NA，沉淀时间是2个小 时左右，如果实验的目的是小RNA,则需要沉淀过夜。4、 4'C,12, OOOXrpm，离心IO分钟，去上清，加lmL 75%乙醇；4'C， 7, 500Xg,离心5分钟，去上清， 真空干燥.溶T30叱DEPC (焦碳酸二乙酯)处理水,待用。5、 力B1叱样品溶液到NanoDrop ND-1000分光光度计中，测定其纯度；然后加入Wg左右的总RNA， W甲醛琼脂糖MOPS (3-吗啉丙磺酸)胶，60 V, 40分钟，检测其完整性。注意本实验中所用耗材均在O. On的DEPC水中浸泡过夜，然后120'C灭菌20分钟；DEPC处理水(RNase Free)是将O. 0W的DEPC水在37'C下放置16小时，然后120'C灭菌20分钟。经NanoDrop测定(表l)，本专利技术提取的总RNA的A260 nm/A280 nm的值为2.00左右，得率每微升菌能 提取35ug左右的总RNA，这说明本专利技术提取的总RM的纯度很高。电泳结果(图l)表明，本专利技术提取的总 RNA的23S rRNA (23S核糖体核糖核酸)、16S rMA和5S rRNA (5S核糖体核糖核酸)三条电泳条带清晰明 亮，5S带浅，且23S/16S的亮度比大约为2: 1,这表明本专利技术提取的总RNA是完整的、高质量的。将本专利技术提取的总RNA进行反转录聚合酶链式(RT PCR)反应，在200 HL PCR管中加入2化经DNase 1 (脱氧核糖核酸酶1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速从抗辐射菌中提取总ＲＮＡ的方法，其特征在于：包括以下步骤：　１）材料：指数生长期的抗辐射菌；　２）ＲＮＡ的提取：裂解：加入５００μＬ细胞裂解液，涡旋混匀；加入１２０－２００μＬ　５０ｍｇ／ｍＬ溶菌酶，５０℃保温１５分钟；抽提：加入１ｍＬ　Ｅｚｏｌ，室温裂解１５分钟；加入２００μＬ氯仿，离心，取上清，然后加入１．５－２．５倍的异丙醇沉淀过夜；样品的清洗和保存：清洗ＲＮＡ样品后加入ＤＥＰＣ水溶解，在－８０℃下保存。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王星星，郭江峰，丁先锋，徐根明，
申请(专利权)人：浙江理工大学，郭江峰，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]