茶树snRNA U6基因及其应用制造技术

本发明专利技术涉及茶树snRNA U6基因及其应用，茶树snRNA U6基因的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，采用qRT-PCR法对茶树不同处理的microRNA(miRNA)进行内参基因筛选，使用geNorm内参筛选软件对候选内参基因U6进行分析，并用Northern blot杂交验证其在茶树的不同器官、不同叶位和不同处理中均可稳定表达，从而证明该snRNA U6基因的表达水平不受不同器官、不同叶位和不同处理的影响，符合作为内参基因的基本特征，从而旁证了该U6基因适合作为茶树miRNA表达分析的内参。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术设及分子生物学领域，具体地说，设及。
技术介绍
snRNA是真核生物转录后加工过程中RNA剪接体(Spliceosome)的主要成分，参与 mRNA前体的加工过程。snRNA U6在很多方面与其他snRNA不同。snRNA U6在不同物种间保守 性都高于其他已知的snRNA。 实时巧光定量PCR(qRT-PCR)技术是在PCR反应体系中加入巧光染料或巧光探针， 利用巧光信号积累实时监控整个PCR反应进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分 析，具有操作简便性，在许多领域有着广泛的应用。运用实时定量巧光PCR(qRT-PCR)检测基 因表达量的一个重要的前提是必须有一个稳定表达的基因作为内参。snRNA U6在真核生物 各种组织和细胞中广泛表达，而且表达水平相对稳定，因此，常被选作内参基因用于 microRNA的定量表达分析。 Nc化them blot杂交技术是一种监测和定量miRNA在植物中表达水平的标准方法， 其基本原理是首先在载体(如玻片或尼龙膜)上固定miRNA样本，再与经过标记的探针杂交， 洗涂多余的杂交探针后进行信号检测;也可W在载体上先固定与祀miRNA序列互补的DNA探 针，然后与经过标记的样本miRNA杂交，进行信号检测。因其灵敏度高，特异性好而被广泛应 用到验证miRNA定量检测中。snRNA U6在Ncxrthern blot杂交过程中也展现了表达稳定的特 性，因此也常被选作内参基因用于Ncxrthern blot杂交中。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供可作为茶树miRNA定量表达分析的内参基因的茶树snRNA U6 基因及其应用。 为了实现本专利技术目的，本专利技术根据NCBI数据库中已公布的植物的snRNA U6CDNA序 列，进行同源性比对，筛选出高度保守的snRNA U6序列（与玉米、扁豆、±豆等植物的U6基因 进行同源对比，结果显示该基因在不同物种中高度保守，同源性高达96.67%，图1)。利用 RACE技术获得茶树snRNA U6基因全长，其cDNA的核巧酸序列如SEQ ID NO: 1所示。 本专利技术还提供所述基因作为茶树miRNA定量表达分析的内参基因中的应用，内参 基因的作用是校正上样量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。[000引本专利技术还提供根据所述基因设计的用于基于巧光定量PCR的miRNA相对定量法中 的内参引物，内参引物序列如下： F:5^-CGGGGACATCCGATAAAATTG-3^ R:5/-GGACCATTTCTCGATTTGTGC-3/ 本专利技术还提供含有所述引物的用于基于巧光定量PCR的miRNA相对定量法的检测 试剂盒。所述试剂盒中还包括反转录酶M-MLV、dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mgh、PCR反应缓冲液 等中的至少一种。本专利技术还提供所述基因作为相对定量中的内参基因在实时巧光定量PCR的茶树 microRNA表达分析中的应用。本专利技术还提供根据所述基因设计的用于基于Nodhern blot技术的miRNA相对定 量法中的杂交探针，探针序列如下:5 '-GGGCCATGCTAATCTTCTCTGTATCGTT-3 '。优选为地高辛 标记探针。本专利技术进一步提供所述基因作为相对定量中的内参基因在基于Nodhern blot技 术的茶树m i cr oRNA表达分析中的应用。 本专利技术首次克隆获得了茶树snRNA U6基因的cDNA序列，设计了巧光定量PCR引物 W及Nc化them blot地高辛探针，采用qRT-PCR法对茶树不同处理的mic;roRNA(miRNA)进行 内参基因筛选，使用geNorm内参筛选软件对候选内参基因 U6进行分析，并用Nodhern blot 杂交验证其在茶树的不同器官、不同叶位和不同处理中均可稳定表达。从而证明了茶树 snRNA U6基因的表达水平不受不同器官、不同叶位和不同处理的影响，符合作为内参基因 的基本特征，可作为茶树microRNA表达分析的内参基因。 本专利技术具有W下优点： ( - )本专利技术提供的方法适用于茶树miRNA的表达分析，操作相对简单，成本较低， 灵敏度高。[001引（二）本专利技术克隆获得了茶树snRNA U6基因全序列，可用于miRNA qRT-PCR的定量 表达分析的内参基因。通过geNorm软件分析，snRNA U6基因的Μ值小于1.5，从而旁证了U6基 因适合作为miRNA表达分析的内参。 (S)本专利技术的茶树snRNA U6基因可用于miRNA No;rthe;rn blot技术中的内参基 因，其不受不同器官、不同叶位和不同处理的影响，表达量恒定。【附图说明】 图1为本专利技术实施例1中茶树snRNA U6基因与玉米、扁豆、±豆、相橘U6基因同源性 比对结果。 图2为本专利技术实施例2中U6内参引物扩增产物的烙解曲线图。 图3为本专利技术实施例帥U6的qRT-PCR扩增产物经2.5%琼脂糖凝胶电泳检测结果； 其中，Μ为DNA分子量标准，1-4为扩增产物，电泳结果显示无非特异性扩增。 图4为本专利技术实施例2中Cq值与Log(起始模板拷贝数)关系图。 图5为本专利技术实施例3中利用geNorm软件分析茶树snRNA U6内参稳定性结果。 图6为本专利技术实施例4中利用茶树snRNA U6基因内参对茶树不同器官、不同叶位和 不同处理下的No;rthe;rn blot结果。【具体实施方式】 W下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例 均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning:a laboratoiy manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。 实施例1茶树snRNA U6基因的获得[002引根据NCBI数据库中已公布的植物的snRNA U6cDNA序列，进行同源性比对，筛选出 高度保守的snRNA U6序列，在其保守区域设计引物，利用RACE技术获得茶树snRNA U6基因 全长，其核巧酸序列如SEQ ID N0:1所示，序列信息如下： 序列特征 长度:105nt [00川类型：核酸 分子类型：cDNA 特性名称：snRNA( 1-105)来源:茶树 序列描述： GTCCCTTCGGGGACATCCGATAAAATTGGAACGATACAGAGAAGATTAGCATGGCCCCTGCGCAAGGATGACACGCA CAAATCGAGAAATGGTCCAAATTTTTTT 根据与其他物种的同源性比对（与玉米、扁豆、±豆等植物的U6基因进行同源对 比，图1 )，结果显示该基因在不同物种中高度保守，同源性高达96.67%。[003引实施例2茶树snRNA U6基因的qRT-PCR引物 利用Primer Premier 5软件，根据茶树snRNA U6基因的cDNA序列设计一对巧光 定量引物。该对引物特异性高，扩增效率为97.3%，且正常扩增效率范围为95%-105%，引 物序列如下(SEQ ID NO:2-3): F:-CGGGGACATCCGATAAAATTG-3^ R:-GGACCATTTCTCGATTTGTGC-3^ 该本文档来自技高网...

【技术保护点】
茶树snRNA U6基因，其特征在于，其cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：韦朝领，宋慧，吴艾琳，王双双，张冉，何雅贤，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34