一种阿米巴原虫的分离与培养技术制造技术

本发明专利技术提出了一项阿米巴原虫的分离培养技术方法，属于微生物学领域。本发明专利技术的主要特征是在自然水体中能够顺利获得纯种的阿米巴原虫，与其他方法相比，本发明专利技术采用分离水生阿米巴方法的优势在于：（1）有效避免细菌和真菌的污染；（2）分离效率高，将培养、分离和纯化有机结合；（3）方法简单，使用无菌接种环便于操作。此外，在培养过程中为避免细菌和真菌污染，本发明专利技术改进了培养方法：（1）在单细胞转移过程中增加缓冲液冲洗频次；（2）低转速离心去除细菌；（3）分离过程中加入抗生素静置。该方法简单、高效、成本低、应用范围广，值得推广。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物学领域，具体涉及一项阿米巴原虫分离与培养技术，在自然水体中能够顺利获得纯种的阿米巴。
技术介绍
自由生活的阿米巴（Free-livingamoeba,FLA）是一种广泛分布于自然水系、土壤、生物膜和人工水体等生境的单细胞原生动物，一些种类属于病原虫，可引发阿米巴性脑炎、脑膜炎、角膜炎、痢疾以及皮肤感染等疾病，有些种类还是人类病原细菌的贮存宿主；由于其在环境中丰度较低，从而限制了直接监测和深入研究，迫切需要建立一种简单、高效、低成本、应用范围广的分离与培养技术。目前，常规的阿米巴分离主要采用平板分离法、稀释法、显微分离法及选择培养法，由于环境中阿米巴丰度较低，且大部分处于有活性但无法培养（Viablebutnon-culturable,VBNC）的状态，上述方法往往很难对环境中阿米巴进行高校分离；另外，传统培养法虽然对设备和技术条件要求不高，但对专业性要求高、且耗时较长，因此，有必要改进现有的阿米巴原虫技术方法，提高分离效率，优化培养条件，为系统深入研究水体病原微生物提供实验材料。阿米巴具有良好的生物相容性且对环境变化敏感，在生命科学、环境科学以及临床医学等领域具有广泛的应用前景；阿米巴在微食物网中起到很重要的作用，可形成孢囊或者不同的形态型来适应环境变化，是研究进化和生态的模式生物之一。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一项阿米巴分离新技术，在优化培养方法的同时提高分离效率；此专利技术所描述的阿米巴通过水体原位过滤富集得到，后续进行扩大培养和分离纯化，并对传统的保藏方法进行优化，获得的阿米巴可以存活并繁殖。本专利技术的优点在于，与其他分离技术相比，本方法简单、易操作、成本低、纯化效率高，适用于多种阿米巴原虫，且广泛应用于不同的采样水体，包括河流、湖泊和水库等生境。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：利用水环境原位采集、过滤富集、培养纯化与分离，根据阿米巴虫体、孢囊结构，以及rRNA基因进行物种鉴定。更确切地，本专利技术所述的技术方法具体包括如下步骤：（1）虫体的采集与富集：用灭菌的试剂瓶取水样1000mL，尽快经100μm筛网预过滤后，过滤至孔径为0.22μm的聚碳酸酯膜上；迅速将滤膜倒置于预先涂有热杀死大肠杆菌（Escherichiacoli）的无营养琼脂（Non-nutrientagar，NNA）培养基上，置于30℃培养；每天于倒置显微镜下观察培养基上滤膜周围是否存在吞噬空斑及阿米巴虫体活动，7天内未发现阿米巴则可视为阴性；（2）阿米巴的培养与分离：无菌条件下进行扩大培养，7天后将含有目的虫体的培养基刮下，用微吸管显微操作挑取单个虫体或孢囊，放入阿米巴生理盐水（Page’samoebasaline，PAS）反复冲洗5次，随后接种到蛋白胨-酵母-葡萄糖培养基（Peptone-yeast-glucosemedium,PYG）中继续培养3天；（3）阿米巴的分离与纯化：将新获得带有虫体的培养液400rpm离心10分钟，弃上清，PAS冲洗1次，重复2次离心和冲洗步骤；按1:1加入青霉素和链霉素至终浓度0.2g/L，静置1小时以上后离心弃上清，加入培养液置于30℃密封培养3天，400rpm离心10分钟后弃上清，即可获得纯化的株系；（4）阿米巴的保种：将分离纯化的阿米巴虫体转移至含有青霉素和链霉素的PYG培养液中，25mL细胞培养瓶30℃培养7-15天；待细胞密度达到107个/mL后取0.1mL培养液，转移至1mL含有90%牛血清和10%二甲基亚砜混合液中，4℃条件下静置72小时，-20℃条件下静置8-12小时，最后置于-80℃保存；（5）阿米巴的形态学物种鉴定：在倒置显微镜下对阿米巴虫体和孢囊的形态特征进行分析，发现阿米巴具有典型的单伪足，体长15-25μm，为体宽的6-8倍，蛞蝓式行动，前端总是有透明帽，体内具有一个囊状细胞核和一个以上伸缩泡；漂浮型虫体呈不规则的球体，辐射伸出6-8个短而钝的伪足；孢囊呈圆球形，直径为5-9μm；阿米巴脱孢囊后可形成漂浮型虫体；基于以上主要形态特征可鉴定为单伪足、单核、蛞蝓状阿米巴；（6）阿米巴的分子鉴定：提取阿米巴DNA后利用特异性引物进行PCR扩增，扩增出18SrRNA基因V3区（502bp）目标序列，纯化测序；通过GenBank的BlastN程序进行序列比对，确认此株阿米巴与已知的Vermamoeba(Hartmannella)vermiformis18SrRNA基因序列具有97-99％同源性。本专利技术中分离水生阿米巴的优势在于：（1）有效避免一些细菌和真菌的污染；（2）分离效率高，将培养、分离和纯化有机结合；（3）方法简单，使用无菌接种环便于操作。根据权利要求1所述的有效避免一些细菌和真菌的污染方法，本专利技术采取了以下措施：（1）在单细胞转移过程中增加缓冲液冲洗频次；（2）低转速离心去除细菌；（3）分离过程中加入抗生素静置。根据权利要求1所述的分离效率高，将培养、分离和纯化有机结合方法，本专利技术采取了以下措施：（1）筛网预过滤自然水体；（2）保种前加入两种广谱抗生素恒温培养；（3）定时定期观察并转移至新的培养基。根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中缓冲液（Page’samoebasaline，PAS）的使用，其作用在于调节阿米巴生长环境中的盐离子平衡的同时将附着在培养容器壁上的阿米巴细胞冲洗到缓冲液中，达到富集的效果，所用量为每个样品200-500μL缓冲液，冲洗3次以上。根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中300-500rpm离心，其作用是使得细胞较小的、抑制阿米巴生长的细菌悬浮在上清液中，离心时间为10-20分钟。根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中静置，其作用为杀死抑制阿米巴生长的细菌和真菌，达到纯化分离的目的，时间为1-4小时。根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中自然水体为湖泊、水库和河流，100μm筛网预过滤分离去除水体中大型的后生动物和真菌，0.22μm聚碳酸酯膜富集，过滤的水量为800-1500mL。根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中广谱抗生素是青霉素和链霉素的应用，是利用了广谱抗生素对多种病原菌有抗生作用，即抑制细菌的生命活动或使其停止生长、死亡，本专利技术中青霉素和链霉素的终浓度为0.1-0.4g/L；采用了密封恒温培养，其作用是避免外源细菌影响阿米巴生长，培养温度为25-35℃。根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中分离过程，采用了定时定期观察培养基滤膜周围是否存在吞噬空斑及阿米巴虫体活动，并及时转移至新培养基的方法，其作用在于及时为处于生长繁殖期的阿米巴补充营养，扩大培养达到富集的效果，同时避免细菌或真菌污染，观察时间间隔为12-36小时，转移时间间隔为2-5天，7-15天未见生长则判断为阴性。附图说明附图为本
技术实现思路
实施技术路线图。具体实施方式实施例阿米巴的分离：（1）虫体的采集本文档来自技高网...

【技术保护点】
本专利技术中分离水生阿米巴的优势在于：（1）有效避免一些细菌和真菌的污染；（2）分离效率高，将培养、分离和纯化有机结合；（3）方法简单，使用无菌接种环便于操作。

【技术特征摘要】
1.本发明中分离水生阿米巴的优势在于：（1）有效避免一些细菌和真菌的污染；（2）分离效率高，将培养、分离和纯化有机结合；（3）方法简单，使用无菌接种环便于操作。
2.根据权利要求1所述的有效避免一些细菌和真菌的污染方法，本发明采取了以下措施：（1）在单细胞转移过程中增加缓冲液冲洗频次；（2）低转速离心去除细菌；（3）分离过程中加入抗生素静置。
3.根据权利要求1所述的分离效率高，将培养、分离和纯化有机结合方法，本发明采取了以下措施：（1）筛网预过滤自然水体；（2）保种前加入两种广谱抗生素恒温培养；（3）定时定期观察并转移至新的培养基。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中缓冲液（Page’samoebasaline，PAS）的使用，其作用在于调节阿米巴生长环境中的盐离子平衡的同时将附着在培养容器壁上的阿米巴细胞冲洗到缓冲液中，达到富集的效果，所用量为每个样品200-500μL缓冲液，冲洗3次以上。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中300-500rpm离心，其作用是使得细胞较小的、抑制阿米巴生长的细菌悬浮在上清液中，离心时间为10-20分钟。
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【专利技术属性】
技术研发人员：杨军，任可欣，于鑫，叶成松，
申请(专利权)人：中国科学院城市环境研究所，
类型：发明
国别省市：福建;35