一种细菌计数方法技术

本发明专利技术提供了一种细菌计数方法，包括以下步骤，S1：利用电聚合法在玻碳电极表面制备聚苯胺/细菌复合薄膜；S2：绘制所述聚苯胺/细菌复合薄膜修饰电极标准曲线；S3：根据所述步骤S2所得标准曲线测定待测菌液样本的细菌浓度。本发明专利技术实施过程中无需对细菌进行培养，因此耗时短、操作简便；本发明专利技术以苯胺为主要试剂，待测液消耗量少，因此检测费用低、设备简单；本发明专利技术所述方法具有重复性好、检测线性范围宽的优点；是一种操作简便、耗时短、成本低的细菌计数方法，本发明专利技术是基于聚苯胺/细菌复合薄膜的细菌计数方法，能实现细菌菌体浓度的快速准确检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于材料科学、微生物学领域，尤其设及一种基于聚苯胺/细菌复合薄膜的 细菌计数方法。
技术介绍
细菌菌体浓度的检测在微生物发酵、环境监测、食品质量检测等领域都具有重要 意义。目前，常用的细菌计数方法为培养法，包括平板计数法、MPN法等。 平板计数法是检测菌落总数的国家标准检验法(参考文献见:GB/T4789.2-2010 食品卫生微生物学检验菌落总数测定)，是判断其他计数方法准确性的标准方法，该方 法对于平皿中的单菌落计数较准确，但由于培养皿中菌落疏密不均匀地排列，依靠人工观 察粘连菌落并计数具有一定的主观性且计数不准确，整体来说该方法操作繁琐、耗时长、误 差大、效率低。 MPN是稀释培养测数法:适用于检测带有大量竞争菌的食品及其原料和未经处理 的含少量金黄色葡萄球菌的食品。MPN法是一种常见的间接计数法，但其存在一定的局限 性。 运些培养法存在耗时较长，无菌操作要求严格，手续繁琐，劳动强度大，受培养条 件影响较大等不足。 为克服培养法的不足，多种计数方法被广泛采用。其中相对可靠并被广泛认可的 有巧光显微镜计数法和流式细胞仪计数法，其中巧光显微镜(Fluorescencemicroscope) 计数法:巧光显微镜是W紫外线为光源，用W照射被检物体，使之发出巧光，然后在显微镜 下观察物体的形状、所在位置及其数量。流式细胞仪计数法是通过激光对通过激光束的颗 粒进行计数，当颗粒或者细胞通过激光束的时候，会对光线产生折射和反射。运个折射和反 射的信号被探测器记录下来。每通过一个细胞，就会产生一个峰值，最后记录峰值的个数。 虽然运两种方法具有快速、准确的特点，但存在设备昂贵，使用和维护成本高等不 足。因此，寻求一种操作简便、快速，成本低的细菌计数方法具有重要价值。
技术实现思路
[000引本专利技术的目的是为了解决现有技术中的不足，提出了一种操作简便、耗时短、成本 低的细菌计数方法，能实现细菌菌体浓度的快速准确检测。 本专利技术的技术方案是:，包括W下步骤： S1:利用电聚合法在玻碳电极表面制备聚苯胺/细菌复合薄膜； S2:绘制所述聚苯胺/细菌复合薄膜修饰电极标准曲线； S3:根据所述步骤S2所得标准曲线测定待测菌液样本的细菌浓度。 上述方案中，所述步骤S1具体包括W下步骤： 1)标准菌悬液准备： 配制细菌培养液，高压灭菌后接种适量菌种进行培养，将培养后所获得菌液离屯、 清洗，便得到标准菌悬液； 2)细菌在玻碳电极表面的固定： 所述玻碳电极进行预处理后，测定其循环伏安曲线，直至氧化-还原峰电位差降至 80mVW内，将所述玻碳电极惊干;取所述标准菌悬液滴至玻碳电极表面后，经烘干即可将细 菌固定在所述玻碳电极表面； 3)苯胺在电极表面的聚合： 将上述固定有细菌的玻碳电极置于含有苯胺的硫酸溶液中采用循环伏安法扫描， 苯胺在玻碳电极表面聚合得到聚苯胺/细菌复合薄膜。 上述方案中，所述硫酸溶液为0.5M，苯胺为0.1M，循环伏安法扫描1~20圈，扫描速 率为5~lOOmV/s，电压下限为-0.6~0V，电压上限为0.75~1.2V。 优选的，所述扫描圈数为10圈，所述扫描速率为50mV/s，所述扫描的电压范围为-0.2~0.9V。 上述方案中，所述步骤S2具体包括W下步骤： 1)将步骤S1所得的标准菌悬液依次按梯度稀释获得不同浓度的菌悬液； 2)利用所获得的不同浓度的菌悬液分别按照步骤S1所述在玻碳电极表面制备聚 苯胺/细菌复合薄膜，蒸馈水漂洗后于0.1M此S〇4溶液中测定其循环伏安曲线，扫描速率为 50mV/s，扫描的电压范围为-0.2~0.9V; 3)W细菌浓度对数为横坐标，W2)中所得循环伏安曲线最高峰所对应的峰电流为 纵坐标，绘制所述聚苯胺/细菌复合薄膜修饰电极标准曲线。 上术方案中，所述步骤S3具体包括W下步骤： 1)利用待测菌悬液按照步骤S1所述在玻碳电极表面制备聚苯胺/细菌复合薄膜， 按照步骤S2所述测定其循环伏安曲线； 2)确定循环伏安曲线的峰电流，根据步骤S2中所得聚苯胺/细菌复合薄膜修饰电 极标准曲线计算其细菌浓度。 现有技术相比本专利技术的有益效果： 1、本专利技术利用电聚合法在玻碳电极表面制备聚苯胺/细菌复合薄膜，由于固定于 玻碳电极表面的细菌对苯胺在电极表面聚合具有阻碍作用，从而使得所制备聚苯胺/细菌 复合薄膜表现出不同的电化学特性，能实现细菌菌体浓度的快速准确检测。 2、本专利技术实施过程中无需像传统平板计数法等对细菌进行培养后再统计，因此耗 时短、操作简便。 3、本专利技术W苯胺为主要试剂，待测液消耗量少，因此检测费用低、设备简单。 4、本专利技术所述方法对同一细菌菌体浓度测量具有重复性好、检测线性范围宽的优 点。【附图说明】 图1为聚苯胺/细菌复合薄膜的整体制备过程示意图。 图2(a)为利用循环伏安法制备聚苯胺-细菌复合薄膜过程中电极循环伏安曲线变 化情况图。 图2(b)为所制备聚苯胺/细菌复合薄膜与纯聚苯胺膜的形貌对比图。 图3(a)为采用不同浓度枯草芽抱杆菌菌悬液所制备聚苯胺/细菌复合膜修饰玻碳 电极在0.1M出S化溶液中的循环伏安曲线图。 图3(b)为聚苯胺/枯草芽抱杆菌薄膜修饰电极的循环伏安曲线在0.2V处峰电流的 标准曲线图。 图4为不同浓度枯草芽抱杆菌菌悬液样本采用平板菌落计数法和本专利技术所述聚苯 胺/细菌薄膜计数法检测结果对比图。 图5为聚苯胺/大肠杆菌薄膜修饰电极的循环伏安曲线在0.2V处峰电流的标准曲 线图。 图6为聚苯胺/嗜热链球菌薄膜修饰电极的循环伏安曲线在0.2V处峰电流的标准 曲线图。【具体实施方式】 下面分别W枯草芽抱杆菌、埃希氏大肠杆菌和嗜热链球菌为【具体实施方式】并结合 附图对本专利技术作进一步详细说明，但本专利技术的保护范围并不限于此。 实施例1 本专利技术使用的苯胺、硫酸、酵母提取物、膜化蛋白腺均购自国药集团化学试剂有限 公司，苯胺经过减压蒸馈后使用。电化学测定采用CHI660D电化学工作站(上海辰华仪器有 限公司）。本实施例W枯草芽抱杆菌为例进行说明，菌种购自中国工业微生物菌种保藏中 屯、。 所述细菌计数方法包括W下步骤：S1、利用电聚合法在玻碳电极表面制备聚苯胺/细菌复合薄膜； 图1显示了聚苯胺/细菌复合薄膜的整体制备过程，具体步骤如下：[004引（1)标准菌悬液准备 取酵母提取物5g，膜化蛋白腺lOg，氯化钢lOg，加水配制成1L培养液，利用化0H调 节抑至7.0，121°C，20min，高压灭菌后接种适量枯草芽抱杆菌菌种，37°C恒溫培养箱培养 20h。将所获得菌液在3500g离屯、力下4°C离屯、lOmin清洗3次，得到标准枯草芽抱杆菌悬浮 液，采用平板菌落计数法测定其菌体浓度为5.33X108CFU·ml/i; (2)细菌在玻碳电极表面的固定 玻碳电极依次用金相砂纸、0.3μηι和0.05μηι的AI2O3粉末抛光，再分别用乙醇、水超 声清洗后，在ImM的K3溶液中测定玻碳电极的循环伏安(CV)曲线，直至氧化-还原 峰电位差降至80mVW内，惊干，确保电极初始状态一致;取10化标准枯草芽抱杆菌悬液滴至 玻碳电极表面，经50°C烘箱15min烘干即可将细菌固定在所述玻碳电极表面，得到细菌/玻 碳电极； (3)苯胺在电极表面的聚合 将上述固定有细菌的玻碳电本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种细菌计数方法，其特征在于，包括以下步骤:S1：利用电聚合法在玻碳电极表面制备聚苯胺/细菌复合薄膜；S2：绘制所述聚苯胺/细菌复合薄膜修饰电极标准曲线；S3：根据所述步骤S2所得标准曲线测定待测菌液样本的细菌浓度。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：邹小波，李志华，黄晓玮，石吉勇，周煦成，胡雪桃，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32