复合可见着色剂及用于定量扩增的方法技术

提供了包含至少一种视觉上可检测的惰性染料和至少一种钝态参比染料的储备溶液以及这种储备溶液与无色的实时PCR主混合物联用的方法。该储备溶液可以添加到预先制备的实时qPCR主混合物中，该主混合物本身能够支持扩增。因此，储备溶液与主混合物的合并能够产生有色的主混合物，着色后便于追踪，将支持扩增。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉参考本申请要求2013年10月10日提交的美国临时专利申请号61/889,358的优先权，其通过引用纳入本文用于所有目的。
技术介绍
实时qPCR能够实现实时的荧光检测和DNA扩增的测量，常用于在许多分子生物学和生物技术应用中输入DNA模板的准确定量。存在几种实时qPCR化学法，最常用的两种是：dsDNA结合(插入)荧光染料，例如SYBR绿色，和5’-核酸酶水解荧光探针(TaqMan)方法。TaqMan方法采用多种荧光报告染料，例如FAM、VIC、NED、5-和/或6-羧基-X-罗丹明(例如，以ROXTM和SuperROXTM商业购得(来自加州佩塔卢马的生物研究技术公司(BiosearchTechnologies))和CY5，其中每一种具有不同的发射光谱用于检测和测量单个反应中的多个靶DNA序列扩增。存在许多不同的实时设备平台，例如来自应用生物系统公司(AppliedBiosystems)的7500和7900，来自伯乐公司(Bio-Rad)(iQ5和CFX96/384)，其中的一些需要内部钝态(passive)参比荧光染料用于孔与孔之间的报告子染料荧光信号标准化以改善定量准确性。荧光染料ROX或FRETROX常用作qPCR和RT-qPCR主混合产品中的钝态参比染料(例如，参见美国专利号5,736,333)。由于热循环器设计的差异，一些设备采用高浓度的5-或6-羧基-X-罗丹明染料实现标准化，而其他则采用低浓度。标准ROX染料的激发/发射最大值在586/610nm，可以在7500上和其他“低ROX”设备上有效激发，提供给每个不同的荧光团通道不同激发波长的光。ROX染料在7900“高ROX”设备上不能被高效激发，仅仅提供单一的488nm激光用于激发所有不同的荧光团，因此需要较高浓度的ROX来产生所需的参比信号强度用于标准化。通常，“高-ROX”平台采用的ROX浓度比“低ROX”平台采用的浓度高约10-倍。FRETROX是一种基于FAM/ROXFRET-的寡聚偶联，可以在586nm处最大值激发作为标准ROX染料，也可以在约488nm处激发用于FAM荧光团，一旦被激发将能量转移至ROX荧光团以在610nm最大值处发射荧光。参见例如，美国专利号5,736,333。含单一浓度的FRETROX的qPCR主混合物可用于所有不同的依赖ROX的设备，不论是低ROX或是高ROX设备。含有限定浓度比例的发射光谱最大值类似于ROX但可以在约488nm处被激发的斯托克斯长位移荧光染料和标准ROX染料的qPCR主混合可用作类似于FRETROX的通用的ROX参比染料，且可用于不同的依赖ROX的qPCR设备上。参见例如，美国专利公开号2012/0164690。微孔板上PCR和其他核酸扩增反应设定可包括移液(1)含有除了核酸模板之外的所有试验组分的主反应混合物，和(2)分别进入各反应孔的含有核酸(例如DNA)模板组分的DNA样品。如果在含有少量体积的微孔板上进行，容易丢失组分是否移液到孔中的痕迹，尤其是在采用白色和非透明孔板的情况下。因此，产生反应设定误差，导致失败的PCR反应。已经采用含惰性可见染料的PCR主混合物来尽可能减小常规PCR和实时PCR的移液误差，市售产品可得，例如西格玛奥德里奇公司(SigmaAldrich)的RedTaqReadyMixPCR反应混合物，赛默飞世尔科技公司(ThermoScientific)的AbsoluteBlueqPCR混合物，DyNamoColorFlashqPCR试剂盒，和LuminarisColorqPCR主混合物，以及生物科技公司(LifeTechnologies)的TaqManGTXpress主混合物(含痕量染料)。
技术实现思路
已经发现，可见染料着色剂可干扰内部钝态染料(例如ROX)信号传导，导致“不良钝态参比信号”的设备QC标识，以及差的Cq标准偏差(STDEV)和定量准确性。该问题可以如本文所述得到解决。本文提供了复合可见染料制剂而解决了该问题，提供了一种与任何实时设备平台上的任何无色qPCR主混合物联用的通用的可见着色剂。在一些实施方式中，提供了一种用于任何市售无色PCR主混合物的反应设定中的移液追踪的独立、浓缩的复合着色剂溶液(含或不含内部钝态参比5-或6-羧基-X-罗丹明染料)，而不影响所需的5-或6-羧基-X-罗丹明染料在其给定实时PCR设备上标准化的性能，其中，所述复合着色剂溶液至少包含1)可见染料和2)钝态参比荧光染料，该钝态参比荧光染料能够补偿PCR期间可见染料吸收对内部5-或6-羧基-X-罗丹明染料染料激发和/或发射的干扰导致的内部钝态参比5-或6-羧基-X-罗丹明染料信号的降低，其中，所述钝态参比染料由FRETROX组成或者由简单的ROX和斯托克斯长位移荧光染料组成，能够在具有大约488nm波长的激发光的PCR设备上以及在具有大约570nm波长的激发光的PCR设备上在大约610nm波长处产生良好的钝态参比信号。在一些实施方式中，提供了一种水性制剂(例如，复合着色剂制剂)，该制剂包含：视觉上可检测的染料；和含有第一荧光团的内部参比分子，所述第一荧光团在激发后在特定波长范围处发射能量；其中，所述视觉上可检测的染料在特定波长范围处部分吸收能量；如果加入到靶核酸和引物中，所述制剂不包含用于靶核酸扩增的充分组分。在一些实施方式中，所述特定波长在615至625nm之间。在一些实施方式中，所述第一荧光团是5-和/或6-羧基-X-罗丹明染料。在一些实施方式中，5-和/或6-羧基-X-罗丹明的浓度大于100nM。在一些实施方式中，5-和/或6-羧基-X-罗丹明的浓度大于1000nM。在一些实施方式中，内部参比分子包含第二荧光团以及连接第一和第二荧光团的接头，使得第二荧光团的激发导致能量从第二荧光团向第一荧光团转移，第一荧光团又在特定的波长范围处发射能量。在一些实施方式中，第二荧光团是荧光素亚酰胺(fluoresceinamidite)(FAM)。例如，内部参比分子可以是“FRETROX”。在一些实施方式中，视觉上可检测的染料选自下组：二甲苯腈蓝(XyleneCyanol)FF，甲酚红，酒石黄(tertrazine)，喹啉黄，间甲酚紫，亮蓝，专利蓝(PatentBlue)，靛胭脂红，酸性红1，中性红，溴甲酚绿，酸性紫5，溴酚蓝和橙G。在一些实施方式中，视觉上可检测的染料是视觉上可检测浓度的整数倍数；内部参比分本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种复合着色剂制剂，包含：视觉上可检测的染料；和包含第一荧光团的内部参比分子，所述第一荧光团激发后在特定波长范围处发射能量；其中：所述视觉上可检测的染料部分吸收所述特定波长范围的能量；和所述制剂不包含如果加入靶核酸和引物足以用于靶核酸扩增的组分。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.10.10 US 61/889,3581.一种复合着色剂制剂，包含：
视觉上可检测的染料；和
包含第一荧光团的内部参比分子，所述第一荧光团激发后在特定波长范围处
发射能量；
其中：
所述视觉上可检测的染料部分吸收所述特定波长范围的能量；和
所述制剂不包含如果加入靶核酸和引物足以用于靶核酸扩增的组分。
2.如权利要求1所述的复合着色剂制剂，其特征在于，所述特定波长范围的
峰值在615至625nm之间。
3.如权利要求1或2所述的复合着色剂制剂，其特征在于，所述第一荧光团
是5-和/或6-羧基-X-罗丹明染料或其衍生物。
4.如权利要求3所述的复合着色剂制剂，其特征在于，所述5-和/或6-羧基-
X-罗丹明染料的浓度大于100nM。
5.如权利要求1所述的复合着色剂制剂，其特征在于，所述内部参比分子包
含第二荧光团以及连接所述第一和第二荧光团的接头，使得所述第二荧光团的激
发导致能量从所述第二荧光团向所述第一荧光团转移，第一荧光团又在所述特定
的波长范围处发射能量。
6.如权利要求5所述的复合着色剂制剂，其特征在于，所述第二荧光团是荧
光素亚酰胺(FAM)。
7.如权利要求1-6中任一项所述的复合着色剂制剂，其特征在于，所述视觉
上可检测的染料选自下组：二甲苯腈蓝FF，甲酚红，酒石黄，喹啉黄，间甲酚

\t紫，亮蓝，专利蓝，靛胭脂红，酸性红1，中性红，溴甲酚绿，酸性紫5，溴酚蓝
和橙G。
8.如权利要求1-7中任一项所述的复合着色剂制剂，其特征在于，
所述视觉上可检测的染料是视觉上可检测浓度的整数倍数；和
所述内部参比分子处于足以补偿在qPCR反应中视觉上可检测的染料在特定
波长范围处导致的钝态参比信号的吸收的浓度的整数倍数；
其中，所述整数倍数在2至1000之间。
9.如权利要求1-8中任一项所述的复合着色剂制剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：付荣典，
申请(专利权)人：生物辐射实验室股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US