硫酸乙酰肝素制造技术

本发明专利技术披露了结合玻连蛋白的硫酸乙酰肝素。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】硫酸乙酰肝素专利
本专利技术涉及硫酸类肝素(heparansulphates)，具体地说，涉及结合玻连蛋白的硫酸类肝素，但不限于此。专利技术背景危重疾病对社会的总体经济成本与干细胞对某些此类问题缓解潜能之间具有着强烈的相关性[1]。这驱使干细胞治疗销售指数增长，虽然它们的有效性还有限[2]。人胚胎干细胞(hESC)和诱导多能干细胞疗法的潜能对这一不断增长的市场有实质性贡献。这些细胞具有分化成成人中所有细胞类型的能力。如果供给可靠的话，人们认为hESC是此类再生治疗策略的核心[3]。hESC定向分化成心肌细胞、肝细胞或特别是产生胰岛素的细胞谱系具备很大希望。在2009年和2010年，美国食品药品管理局(FDA)批准的两项临床实验以便治疗A级胸段脊髓损伤(NCT01217008和NCT01344993)[4]以及黄斑营养不良和干燥性年龄相关黄斑变性(NCT01345006和NCT01344993)[5]，两项实验利用人胚胎干细胞来源的细胞。然而，依然存在的问题是，非常难于在其分化之前将这些细胞持续保持在原始状态，该特性对于确保有足够的细胞可用于后续定向分化以满足将来的临床需求是至关重要的。首要的，也是最重要的挑战是减轻hESC维持对于灭活小鼠或人饲养细胞层的依赖。第二是要杜绝使用MatrigelTM，这是从鼠科肉瘤基底膜得到的有用、但成分不确定的产品。第三，细胞培养基中不用牛血清白蛋白(BSA)和胎牛血清(FCS)将是一大进步。如果我们要安全性最高地、以原初状态大量繁殖细胞，需要克服这些障碍。细胞培养基配方已取得快速进展，目前有许多化学成分确定的培养基可用，例如XVIVO-10、hESF9、mTeSRTM1和STEMPRO[6-9]。然而，在适当确定成分的细胞培养表面的领域，仍然有许多工作要做。尽管许多研究小组提出了包括层粘连蛋白(LN)[10,11]、玻连蛋白(VN)[12]、纤连蛋白(FN)[13]、E-钙粘蛋白[14]、肽[15,16]或PMEDSAH聚合物[17]的hESC培养方法，但这些研究均未计算所施加化合物的实际表面密度，也没有计算这些方法用于商业规模hESC繁殖的经济成本效益。固定胞外基质(ECM)蛋白以供细胞培养的最广泛使用的方法是通过被动吸附到培养表面。之前我们已经证明，hESC能够在吸附玻连蛋白(VN)的表面长期成功繁殖[18]。但是，马森(Marson)等证明这种方法导致VN的空间位阻或构象扰动，从而造成蛋白的功能丧失[19]。糖胺聚糖是一类复杂的、线形、高度负载的碳水化合物，与各种蛋白质相互作用以调节它们的功能；它们通常合成并附着于核心蛋白。GAG分为非硫酸化(HA)和硫酸(CS、DS、KS、肝素和HS)。在GAG中，硫酸乙酰肝素(HS)家族因为能够基于其结构域内的特定序列与靶蛋白相互作用而特别令人感兴趣。该家族(肝素和HS)由具有不同N-和O-硫酸化模式的重复糖醛酸-(1→4)-D-葡糖胺二糖亚单位构成。例如，肝素的抗凝血活性需要葡糖胺残基中的3O-硫酸化，具有独特的五糖配置[20]。对于ECM蛋白，独特的硫酸化模式也是明显的；结合FN的强肝素结合变体尤其是高度负载的，需要7-8个N-硫酸化二糖并且结构域比通常情况大(>14个残基)[21,22]。然而，HS与此类硫酸肝素的区别在于具有由未硫酸化NA结构域隔开的高度硫酸化NS结构域；这种配置方式为选择性结合蛋白质提供了独特的排布，同时不具备肝素的副作用[23]。可以利用肝素黄杆菌(Flavobacteriumheparinium)的肝素酶I、II和III切割糖苷键，从而通过一系列的酶切割作用来阐明HS的双糖组成[24-26]。当联用所有3种肝素酶时，可能解聚90％以上的肝素或HS[27，28]。可以通过PAGE[29]、SAX-HPLC[30]、或高灵敏度毛细管电泳(CE)[31-34]，与已知的二糖标准品作比较来分析得到的二糖混合物。许多研究已显示HS对于干细胞的维持和增殖很重要[15,35-38]。Uygun等证明，与TCPS表面相比，GAG-衍生表面能促使间充质干细胞生长提高5倍[39]。该可能性本身表明可能特定HS变体的调控方式可能以以更有效的方式呈递VN。固定策略包括将GAG与BSA偶联以吸附到表面上[40，41]；EDC化学方法以共价固定二糖单元[42]；GAG的生物素化和偶联于链霉亲和素涂布表面[43-45]，和带正电等离子体的聚合物薄膜[19，46]。为在此类衍生化表面上分析元素组成，可采用诸如XPS等技术[47]。在此，我们描述了对具有高VN-结合能力的HS变体的寻找，从而提高VN表面密度以供细胞培养。我们首先描述了通过亲和层析，利用VN-肝素结合域(VN-HBD)作为为捕获配体，从原始HS起始材料纯化新型VN-结合性HS物质。然后采用全系列生化分析以确认从非结合性起始材料纯化的这种HS的结合能力。然后通过ELISA和CE分析HS的长度、硫酸化方式和组成需求。然后评估三种不同策略对于将纯化的HS变体固定到TCPS上的适用性。相比于测试的其它方法，利用烯丙胺的方法可提供明显的优势。因此，利用这些方法呈递足够的VN以供hESC培养的效率并不高。不同于修饰蛋白质(如此可能导致有害的影响)，修饰表面以供有效的VN固定看来是更合理的思路。在此，我们研究了各种策略，从而能捕获充足的未修饰VN以供hESC培养，这些策略同时也是廉价、可放大和高效的。专利技术概述本专利技术涉及硫酸乙酰肝素制品，硫酸乙酰肝素HS9。现已发现HS9能结合玻连蛋白，并显示能用于提供细胞培养基材，所述基材能够支持干细胞的培养和增殖，同时保持所培养干细胞的干性(例如多分化性或多能性)。HS9是指新的一类结构和功能相关的分离硫酸乙酰肝素。本专利技术一方面提供了硫酸乙酰肝素HS9。可以采用分离的形式或基本上纯化的形式提供HS9。这可包括提供一组合物，其中硫酸乙酰肝素组分是至少80％的HS9，更优选以下任一的HS9：至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在优选的实施方式中，HS9能够结合具有PRPSLAKKQRFRHRNRRGYRSQRGHSRGRNQNSRR(SEQIDNO:1)或PRPSLAKKQRFRHRNRKGYRSQRGHSRGRNQNSRR(SEQIDNO:3)所示氨基酸序列的肽或多肽。所述肽可以在该序列的一端或两端具有一个或多个额外的氨基酸。例如，所述肽可以在该序列的一端或两端具有以下任意个氨基酸：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或更多个。在其它实施方式中，所述多肽是玻连蛋白。在一些实施方式中，HS9结合的肽具有或由SEQIDNO:1、SEQIDNO:3或玻连蛋白中任一的氨基酸序列组成，其中KD小于100μΜ，更优选小于50μΜ、40μΜ、30μΜ、20μΜ、10μΜ、1μΜ、100nΜ、10nΜ、1nΜ或100pΜ。可以根据专利技术人的本文所述方法获得、鉴定、分本文档来自技高网...

【技术保护点】
硫酸乙酰肝素HS9。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.05.27 SG 201304059-71.分离的或基本上纯化的硫酸乙酰肝素HS9，其特征在于，所述HS9特异性结合玻连蛋白，所述HS9通过以下方法获得，所述方法包括：(i)提供一固体支持物，所述支持物上附着有多肽分子，其中所述多肽包含具有以下氨基酸序列的肝素结合域：PRPSLAKKQRFRHRNRRKGYRSQRGHSRGRNQNSRR或PRPSLAKKQRFRHRNRKGYRSQRGHSRGRNQNSRR；(ii)使所述多肽分子与从猪肠粘膜获得的含有糖胺聚糖的混合物接触，从而形成多肽-糖胺聚糖复合物；(iii)将该多肽-糖胺聚糖复合物与该混合物的其余部分分开；(iv)从该多肽-糖胺聚糖复合物中解离糖胺聚糖；(v)收集解离的糖胺聚糖；并且用肝素酶I、II和III消化，然后对得到的二糖片段进行毛细管电泳分析后，所述硫酸乙酰肝素HS9具有的二糖组成包括：2.一种组合物，包含权利要求1所述的分离的或基本上纯化的硫酸乙酰肝素HS9。3.一种药物组合物，包含权利要求1所述的分离的或基本上纯化的硫酸乙酰肝素HS9。4.如权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包含玻连蛋白。5.如权利要求3或4所述的药物组合物在制备用于医学治疗方法的药物中的用途。6.权利要求1所述的分离的或基本上纯化的硫酸乙酰肝素HS9在...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·酷尔，V·纳康比，
申请(专利权)人：新加坡科技研究局，
类型：发明
国别省市：新加坡;SG