赫氏颗石藻的培养方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种培养赫氏颗石藻的培养基组合物，包括以下组分：海水+不含Si的f/2培养基+11μM NaFeEDTA+5mM Serine+3mM NaHCO3+1％-2.5％的赫氏颗石藻病毒裂解液。本发明专利技术还公开了一种培养赫氏颗石藻的方法，本发明专利技术具有成本低、收益大、无污染、操作简单，易于规模化培养的优点，将对赫氏颗石藻和神经酰胺产业的跨越式发展起到重要的推动作用，应用前景广阔。本发明专利技术还公开了一种赫氏颗石藻神经酰胺的制备方法，用上述培养方法获得的神经酰胺可以制成抗肿瘤、抗衰老等药物，还可作为高档护肤品美容保湿的添加剂。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于海洋植物培育
，具体涉及一种培养赫氏颗石藻的方法，本专利技术还涉及一种培养赫氏颗石藻的培养基，本专利技术还涉及一种赫氏颗石藻特异病毒的制备方法。
技术介绍
赫氏颗石藻Emiliania huxleyi是一种广泛分布于全球近海和大洋的的单细胞真核微型浮游植物，隶属于定鞭藻门(Prymnes1phyta)，定鞭藻纲(Prymnes1phyceae)。赫氏颗石藻能够产生丰富的次级代谢生物活性物质，在医药、食品和日用化工等研究领域具有广阔的应用前景，如能有效合成和积累具有防止心血管疾病等药理功能的Ω-3长链多元不饱和脂肪酸二十二碳六稀酸(DHA) (Sayanova 0, Has lam RP, Caleron MV, etal.1dentificat1n and funct1nal characterisat1n of genes encoding theomega-3polyunsaturated fatty acid b1synthetic pathway from the coccolithophoreEmiliania huxley1.Phytochemistry, 2011, 72 (7): 594-600);能够合成大量的具有良好的抗菌、抗虫、抗肿瘤等生物学活性物质，如聚酮类化合物(Read BA, Kegel J, Klute MJ, etal.Pan genome of the phytoplankton Emiliania underpins its global distribut1n.Nature, 2013.499 (7457): 209-13)；特别是该藻能够合成一种新型的神经酰胺类物质，其具有自然界罕见的特殊结构，该结构的神经酰胺具有较高的生物学活性(MichaelsonLV, Dunn TM, Napier JA.Viral trans-dominant manipulat1n of algal sphingolipids.Plant Sci,2010，15(12):651-655.)。神经酰胺是细胞中的一种信号传导物质，对细胞分化、增殖、免疫、凋亡及衰老等生命活动具有重要调节作用。目前，商品化的天然神经酰胺价格高达6000美元/kg，美国每年神经酰胺类产品的产值在100亿美元以上。作为一种新型的生物活性物质，神经酰胺特有的生理功能及药物功效使其成为一种附加值极高并具有巨大市场潜力的活性物质，在化工、医药、食品、特别是高档护肤品等领域中具有广阔的应用前景。目前国内外天然神经酰胺产品均为植物源神经酰胺，主要从大米、小麦、玉米、米糠和魔芋等原料中提取，但含量甚微，一般占生物量干重的0.01% -0.2%。因此，天然神经酰胺产量较低是制约神经酰胺功能性产品开发的瓶颈，使其商业化应用存在经济性的挑战。目前已陆续从海洋生物如，海绵和珊瑚中提取到了新型的神经酰胺，而且发现源于这些海洋生物的神经酰胺具有特殊的结构，其生物学活性远远高于任何陆地生物来源的神经酰胺。与海绵及软体动物珊瑚等相比，海洋微藻生长快、周期短、易培养且细胞中总脂含量相对较高。因而，在生物活性物质开发利用中无疑具有更强的优势。目前，几乎所有商业化的微藻培养体系都是在开放式池中，但是，并不是所有的物种都能在开放式池中培养，如球石藻(coccolithophorid)中的Pleurochrysiscarterae能在户外跑道式池中生长至少10个月，而赫氏颗石藻(E.huxleyi)和I丐板金藻(Gephyrocapsa oceanica)却不能利用这种方式培养(Moheimani and Borowitzka, 2006)。研究发现，板式光生物赫氏颗石藻中颗石藻(p.carterae)、赫氏颗石藻(E.huxleyi)和|丐板金藻(G.0ceanica)最理想的封闭培养体系，采用半连续方式培养，颗石藻(P.carterae)能达到的最大细胞密度为4.1 X 105cells.mL \ E.huxleyi能达到5.9X 105cells.mL \ G.0ceanica能达到2.4X 105cells.mL、这三种都能在玻璃光生物反应器中生长(Navid R.Moheimani,Andreas Isdepsky, Jan Lisec,et al.Coccolithophoridalgae culture in closed photob1reactors.B1technology and B1engineering，2011，108(9):2078-2087)，而这些培养均在自养条件下利用不含Si的f/2培养基。目前赫氏颗石藻采用常规培养基培养所能达到的生物量仍处于较低水平。因此，迫切需要寻找既能提高赫氏颗石藻生物量又能提高细胞内神经酰胺积累的培养方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种培养赫氏颗石藻的培养基组合物，采用可提高赫氏颗石藻生物量，又可促进细胞内神经酰胺积累的培养基组合物，该培养基可使赫氏颗石藻达到高密度培养的前提下，藻体品质与自养培养相比有较大幅度提高。本专利技术的另一目的是提供一种赫氏颗石藻的培养方法，采用可提高赫氏颗石藻生物量，又可促进细胞内神经酰胺积累的培养基组合物，该培养基可使赫氏颗石藻达到高密度培养的前提下，藻体品质与自养培养相比有较大幅度提高。本专利技术的另一目的是提供一种赫氏颗石藻神经酰胺的制备方法。本专利技术所采用的第一技术方案是，一种用于培养赫氏颗石藻的培养基组合物，包括以下组分:不含 Si 的 f/2 培养基 +11 μM NaFeEDTA+5mM Serine+3mM NaHC03+l% -2.5%的赫氏颗石藻病毒裂解液。进一步地，不含Si的f/2培养基海水的盐度为18%。。进一步地，病毒裂解液的制备方法:将分离自挪威西南海岸的赫氏颗石藻特异性病毒EhV99Bl感染处于对数后期的赫氏颗石藻E.huxleyi B0F92 (分离自挪威西南海岸)，待藻培养液被病毒裂解变得清澈透亮(即藻细胞已被裂解完全)，裂解液用孔径为0.45 μ m的混合纤维素酯滤膜过滤，过滤液用Masterflex I/P Easy-Load婦动栗以5mL/min的流速栗进，经Millipore pellicon卷式膜包(其截留分子量为30kDa)切向流超滤浓缩后(此过程中控制回流速度为0.5mL/min)，获得病毒裂解浓缩液和病毒裂解收集液(其中病毒裂解收集液中不含病毒颗粒)。本专利技术所采用的第二技术方案是，一种赫氏颗石藻的培养方法，包括以下步骤:1)、制备用于培养赫氏颗石藻的培养基组合物；2)、将赫氏颗石藻按4.5X105cells/mL的密度接种于用于培养赫氏颗石藻的培养基组合物上；3)、培养体积为50mL，在18?20°C，光照强度为15?25 μ mol.m 2.s \光照时间为12L: 12D的条件下静止培养赫氏颗石藻，每天搅拌或者摇瓶1?2次；以接种的时间算起，隔天取样一次，并在显微镜下用血球计数板计数，用公式μ zLnWt-Nj/t，其中，队为经过t时间培养后单位体积的藻细胞数；N。为t时间培养初始单位体积藻细胞数；t为培养的时间；μ为赫氏颗石藻的每天平均生长率，以检测添加培养组合物后赫氏颗石本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种培养赫氏颗石藻的培养基组合物，其特征在于，包括以下组分：不含Si的f/2培养基+11μM NaFeEDTA+5mM Serine+3mM NaHCO3+1％‑2.5％的赫氏颗石藻病毒裂解液。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：刘静雯，李丽华，
申请(专利权)人：集美大学，
类型：发明
国别省市：福建;35