本发明专利技术属于植物基因工程领域，提供了AQP基因3’-UTR及其在控制基因表达中的应用，AQP基因3’-UTR序列如SEQ ID NO.1所示，是将编码AQP基因3’-UTR的核苷酸序列与报告基因GUS重组后，通过转基因技术将其整合到植物细胞中，随宿主基因组表达。带有3’-UTR的GUS与带有Tnos的GUS相比，蛋白产物显著增加。本发明专利技术还提供了AQP基因3’-UTR在转基因植物中的应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物基因工程领域，具体涉及AQP基因mRNA的3’ -UTR在调控基因表达中的应用。技术背景植物基因表达过程分为启动子的启动、转录起始、延伸及终止。基因的启动需要启动子，同样，基因表达的终止也需要可靠的终止子。基因工程在很大程度上有赖于基因转录的有效启动和终止。真核生物中，转录和翻译的过程在空间和时间上是分开进行的，转录过程中的调控和转录后水平的调节对基因的表达调控都是十分重要的。一个转录本的总体结构是由 5’端非翻译区(5，untranslated reg1n，5’-UTR)、编码区(open reading frame，ORF)和3’端非翻译区(3，-UTR)三部分组成。3’端非翻译区(3，untranslated reg1n，3’ -UTR)是真核生物特有的序列结构之一，3’ -UTR通过影响mRNA的积累、稳定性和翻译效率，在调控基因表达的转录和转录后水平中起到重要作用。目前植物基因工程中常用的终止子是Tnos，除此以外其他的终止子很少，寻找可替代Tnos的终止子对于植物基因工程技术的应用具有重要意义。水通道蛋白是近年来发现的、普遍存在于动物、植物及微生物生物膜中的一类特异的水分转运蛋白，是一种位于细胞膜上的蛋白质，在细胞膜上组成“孔道”，可控制水在细胞的进出，通过水通道蛋白实现的水分快速跨膜转运，与植物的生长发育、细胞伸长和分化、果实成熟及种子萌发以及非生物胁迫应答等多种生理过程有关。前期研究显示，水通道蛋白大量存在于参与水分、离子集流的细胞中，这些细胞往往是正在分裂和伸长的细胞及幼嫩部位，如表皮细胞、幼穗以及正在发育的根和芽等。其分布表现出明显的器官、组织和细胞特异性。是一种组成型表达基因，又具有组织特异表达特性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供AQP基因mRNA的3’ -UTR及在调控基因表达中的应用。本专利技术通过以下技术方案实现: 所述AQP基因3’ -UTR，基因序列如SEQ ID N0.1所示。为了实现本专利技术目的，其是将编码AQP的3’ -UTR的核苷酸序列与报告基因⑶S序列重组，获得⑶S-AQP 3’ -UTR的重组基因，然后整合至宿主基因组中，并随宿主基因组表达。具体为:依据AQP基因mRNA 3’ -UTR的DNA序列设计特异性引物，引物序列F:5’ AGCGAGCTCGAGCCTCGTTCAAGTGGTG 3’，R:5’ ACCGGAATTCAGTTTTCAATACCTTTCA 3’，以“日本晴” DNA为模板，PCR扩增目的条带，回收纯化后，与载体PMD-18T连接测序。载体pCUb1-GUS -Tnos用EcoR I和Sac I双酶切，将AQP基因3’_UTR片段替换Tnos形成重组质粒pCUb1-GUS-AQP3’ -UTR，酶切鉴定。将正确的重组质粒导入农杆菌LBA4404，用于农杆菌转化。农杆菌转化过程包括: 1)种子消毒和愈伤诱导； 2)农杆菌pCUb1-GUS-AQPl 3’ -UTR/LBA4404 制备； 3)侵染及共培养； 4)抗性愈伤筛选； 5)抗性愈伤分化、幼苗生根。转基因小苗移栽、检测、筛选出超表达的转基因植株，通过自交重组，获得转基因纯合株系。种植T1代水稻，分别取转基因纯合株系花期根、茎、叶、花器官以及成熟种子。部分用于组织化学法检测样品GUS蛋白(JefferSonl987);部分用于提取蛋白测定总蛋白含量和GUS酶活性。所述宿主为水稻。所述编码AQP的3’ -UTR的核苷酸序列如SEQ ID N0.1，以及该序列替换、缺失或添加若干个核苷酸形成的具有与AQP的3’ -UTR同等功能的核苷酸序列。本专利技术的优点在于:本专利技术提供的AQP的3’ -UTR片段可替代Tnos，作为基因表达调控序列，可应用于植物基因工程。特别是水稻的基因工程修饰，利用来源于水稻自身的序列培育转基因水稻，能够避免使用外源调控序列带来的安全隐患。【附图说明】图1 AQP基因3' -UTR核苷酸序列连接在⑶S表达载体pCUb1-GUS-AQP 3’ -UTR上的表达框示意图。图2转基因水稻不同组织器官⑶S组织化学染色图。其中A、B、C、D、E分别为根、茎、叶、花和种子。U3为转pCUb1-GUS-AQP 3’ -UTR载体水稻；UT为转pCUb1-GUS_Tnos水稻，作为阳性对照；CK为非转基因水稻，为阴性对照。图3转基因水稻⑶S蛋白酶活性检测法验证AQP 3 ’ -UTR在转基因水稻上的功能。其中⑶S-AQP 3’ -UTR 为转 pCUb1-GUS-AQP 3’ -UTR 载体水稻；CK 为转 pCUb1-GUS_Tnos 水稻，作为阳性对照。【具体实施方式】下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步阐述。这些实施例仅用于说明本专利技术而不限于本专利技术的范围。实施例1 AQP基因mRNA的3’ UTR的克隆及序列分析 以“日本晴”水稻为材料，采用改进的CTAB法(Sambrook et al，1989)提取基因组DNA的提取。以“日本晴”水稻DNA为模板，依据AQP基因mRNA 3’ -UTR对应的DNA序列，用Primer5.0 设计特异性引物，引物序列为 F:5’ AGCGAGCTCGAGCCTCGTTCAAGTGGTG 3’，R:5’ACCGGAATTCAGTTTTCAATACCTTTCA 3’。用 Golden DNA Polymerase 扩增目的片段，PCR 反应体系(50ul)为:“日本晴”水稻 DNA 2uL，F 和 R 引物各 luL,Golden DNA Polymerase (2.5U/uL) luL，2xReact1n Mix 25uL，最后用灭菌的ddH20补齐至50uL，目的片段大小322bp，电泳检测扩增条带，正确后用1%琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒回收3’ -UTR片段，与载体PMD-18T连接转化后送生物公司测序，序列如SEQ ID N0.1所示。序列分析显示AQP基因mRNA的3’ -UTR含有6个多聚信号元件。实施例2 pCUb1-GUS-AQPl 3’ _UTR植物表达载体的构建及其转基因水稻获得 用限制性内切酶 Hind III和 BamH I 将载体骨架 pCXGUS-P (genebank ID: FJ905224)(Chen S.et al., 2009)酶切回收，与Ubiquitin启动子片段连接，构建重组质粒pCUb1-GUS-Tnos。再用限制性内切酶EcoR I和Sac I双酶切重组质粒pCUb1-GUS_Tnos，用AQP 3’ -UTR片段替换pCUb1-GUS-Tnos中的Tnos，所构建的质粒命名为pCUb1-GUS-AQP3’ -UTR,将该质粒电击到农杆菌LBA4404菌株，鉴定正确后，用于转化水稻，鉴定AQP3’-UTR的功能。所构载体的表达框示意图见图1。将pCUb1-GUS-AQP 3’ UTR重组质粒通过农杆菌介导法导入“日本晴”水稻，所获转化植株经30mg/L潮霉素筛选、PCR检测鉴定为转基因植株后，种植于温室中，T0代水稻自交后，收获T1代种子。实施例3⑶S组织化学染色法验证AQP 3’ UTR在转基因水稻上的功能 选T1代纯合株系水稻，于开花本文档来自技高网...
【技术保护点】
AQP基因3’‑UTR，其特征在于：所述基因序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：苏军，管其龙，李刚，林智敏，胡太蛟，颜静宛，
申请(专利权)人：福建省农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：福建;35
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