一种抗烟草花叶病毒的N′au基因及其克隆方法和应用技术

本发明专利技术涉及烟草花叶病毒（TMV）抗性基因N'au的分离克隆与育种应用。本发明专利技术公开了烟草抗TMV基因N'au的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的多肽的氨基酸如SEQ ID NO.2所示。将种质资源包含的N'au基因通过常规育种手段转育至感TMV主栽烟草品种中，可得到非转基因抗TMV烟草品种。本发明专利技术的N'au基因在主栽烟草品种中具有核苷酸一致率高的同源序列，因此常规育种容易获得较短的携带N'au基因的渐渗片段单株，从而获得连锁累赘较小的抗TMV品种。该基因能同时抗TMV的U1和Cg株系，本发明专利技术所述的新抗病基因N'au对于培育抗TMV烟草具有重大应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物保护
，进一步属于烟草病毒防治
，具体涉及一种抗烟草花叶病毒的N'au基因及其克隆方法和应用。
技术介绍
烟草花叶病毒病（Tobaccomosaicvirus,TMV）是中国重要的烟草病害，每年造成的损失位列十大烟草侵染性病害名单前列(朱贤朝，2002)。TMV病毒存在TMV-Cg株系和TMV-U1株系等株系分化，其中，TMV-U1株系是烟草上的主要危害株系。中国烤烟主栽品种K326和云烟87等均不抗TMV-U1株系，一般主要采取培育无毒苗、药剂防治和销毁田间病残体等措施防治，对控制TMV的发生和流行上有一定的效果，但TMV在局部田块爆发的情况仍然时有发生，造成较大的经济损失（朱贤朝，2002）。因此，种植TMV抗病品种依然是防控TMV最根本、最经济有效的手段；而对抗病品种的要求是抗性高、无产量劣势、无农艺性状劣势。目前，烤烟的TMV抗源主要来源于烟草野生种心叶烟（Nicotianaglutinosa），其抗性由一个显性单基因（N）控制，N基因抗TMV-U1株系。N基因于1994年被克隆，是植物中克隆的第一个NBS类抗病基因（Whitham,1994）。N基因的基因组序列大小为6656bp，包括5个外显子和4个内含子，属于TIR-NBS-LRR类型抗病基因。在其编码蛋白的N端编码一个与果蝇Toll蛋白及哺乳动物白细胞介素-1受体(Toll/interleukin-Ireceptor，TIR)的胞外域相似的结构，还编码核苷酸结合位点(nucleotide-binding-site，NBS)和富含亮氨酸的重复序列(1eucine-richrepeat，LRR)结构域（Whitham,1994）。N基因的抗病机理为在病毒侵染位点出现过敏性坏死斑（枯斑），通过诱导产生的细胞过敏性死亡限制TMV在植物体内的移动。在介导了过敏反应后，烟草植株能够获得系统性抗性，对TMV或其它类似病原的再次入侵产生广谱抗性（Whitham,1994）。通过一系列的常规杂交和回交转育，N基因的抗性从心叶烟先转育至香料烟中，后转育至烤烟品种中（Bagley,2002）。采用杂交育种转育N基因的抗性，实际上是转育携带N基因的染色体片段（简称为N导入片段）。世界上抗TMV烤烟育种利用的抗TMV基因几乎都是N基因。代表性品种是较早商业化种植的携带N基因渐渗片段的抗TMV烤烟品种Coker176和SpeightH20。由于产量较低、上部叶落黄较慢等连锁累赘，携带N基因的烤烟品种不能满足生产的迫切需要。与N基因紧密连锁的来源于心叶烟的染色体片段存在连锁累赘、已被育种利用的TMV抗源的遗传背景狭窄和常规育种手段的局限性，导致抗TMV烤烟育种缺乏突破性进展。因此，在烟草种质资源库中筛选、鉴定新的抗TMV基因具有重大意义。另外，烟草野生种存在一种N'基因，对应的无毒基因为烟草花叶病毒属病毒的外壳蛋白基因（Coatprotein，简写为CP），属于CC-NBS-LRR类抗病基因(Sekineetal.，2012)。N'基因抗TMV-Cg株系但不抗TMV-U1株系。为此，本专利技术希望寻找到一种能抗TMV病毒的新基因。
技术实现思路
本专利技术第一目的在于提供一种抗烟草花叶病毒的N'au基因；第二目的在于提供一种所述抗烟草花叶病毒的N'au基因的克隆方法；第三目的在于提供一种所述抗烟草花叶病毒的N'au基因编码的多肽；第四目的在于提供一种所述抗烟草花叶病毒的N'au基因的瞬时表达载体；第五目的在于提供一种所述抗烟草花叶病毒的N'au基因的瞬时表达载体的构建方法；第六目的在于提供一种所述抗烟草花叶病毒的N'au基因的应用；第七目的在于提供一种根据所述抗烟草花叶病毒的N'au基因的应用所得到的烟草品种、及其种子和无性繁殖体；第八目的在于提供一种所述抗烟草花叶病毒的N'au基因的表达盒；第九目的在于提供一种所述抗烟草花叶病毒的N'au基因的转基因细胞系；第十目的在于提供一种含所述抗烟草花叶病毒的N'au基因的重组菌。本专利技术第一目的是这样实现的，所述抗烟草花叶病毒的N'au基因的碱基序列如SEQIDNo.1所示。本专利技术第二目的是这样实现的，所述抗烟草花叶病毒的N'au基因的克隆方法包括如下步骤：（1）以Nicotianaalata的总DNA为模板，进行PCR扩增，使用的用上下游引物分别为：N'-H8-F：5’-ATGGAGATTGGCTTAGCAGT-3’，N'-H8-R：5’-TCACAGGCATTCACAATCGA-3’；（2）将得到的PCR产物进行回收和纯化；（3）测序。本专利技术第三目的是这样实现的，所述抗烟草花叶病毒的N'au基因编码的多肽的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。本专利技术第四目的是这样实现的，所述抗烟草花叶病毒的N'au基因的瞬时表达载体包括N'au基因和载体pHellsgate8。本专利技术第五目的是这样实现的，所述抗烟草花叶病毒的N'au基因的瞬时表达载体的构建方法为采用限制性内切酶XhoI和XbaI酶切载体pHellsgate8，胶回收的N'auPCR扩增产物,使用一步法无缝克隆试剂盒与线性pHellsgate8载体连接。本专利技术第六目的是这样实现的，所述抗烟草花叶病毒的N'au基因的应用是通过染色体片段导入、或基因导入、或基因编辑得到含N'au基因的烟草植株。本专利技术的第七目的是这样实现的，根据所述抗烟草花叶病毒的N'au基因的应用所得到的烟草品种、及其种子和无性繁殖体。本专利技术的第八目的是这样实现的，所述抗烟草花叶病毒的N'au基因的表达盒。本专利技术的第九目的是这样实现的，所述抗烟草花叶病毒的N'au基因的转基因细胞系。本专利技术的第十目的是这样实现的，所述抗烟草花叶病毒的N'au基因的重组菌。本专利技术提供的对TMV-U1和TMV-Cg株系均有抗性的N'au基因具有重要的应用价值，通过杂交育种、转基因、基因突变等手段培育出广谱抗性的烟草品种。常规育种容易获得携带N'au基因且连锁累赘较小的抗TMV品种。经研究发现：N'au基因在栽培烟草品种如云烟87等中存在相似性较高的同源序列，携带N'au基因的渐渗片段容易与栽培品种发生交换，容易获得携带N'au的渐渗片段较短的单株，因此，常规育种容易获得携带N'au基因且连锁累赘较小的抗TMV品种。与之相比，携带N基因的烟草野生种心叶烟的渐渗片段较长、且与在栽培烟草品种如云烟87的核苷酸同源性较低，携带N基因的渐渗片段很难与栽培品种发生交换，常规育种难以获得较短的渐渗片段单株，因此，难以获得携带N基因且连锁累赘较小的抗TMV品种。附图说明图1为4种烟草品种接种TMV-U1株系病毒；图中：A为N.alata(PI42334)，表现枯斑；B为Coker176，表现枯斑；C为N.sylverstris（PI555569），表现花叶、无枯斑；D为K326，表现脉明花叶、无枯斑。图2为使用分子标记N1/N2和E1/E2检测N基因；图中：1为N.alata(PI4本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗烟草花叶病毒的N'au基因，其特征在于所述的抗烟草花叶病毒的的N'au基因的碱基序列如SEQ ID No.1所示。

【技术特征摘要】
2015.10.09 CN PCT/CN2015/0915601.一种抗烟草花叶病毒的N'au基因，其特征在于所述的抗烟草花叶病毒的的N'au基因的碱基序列如SEQIDNo.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种抗烟草花叶病毒的N'au基因，其特征在于所述烟草花叶病毒的株系为TMV-U1、TMV-Cg。
3.一种根据权利要求1所述的抗烟草花叶病毒的N'au基因的克隆方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）以Nicotianaalata总DNA为模板，进行PCR扩增，使用的用上下游引物分别为：
N'-H8-F：5’-ATGGAGATTGGCTTAGCAGT-3’，
N'-H8-R：5’-TCACAGGCATTCACAATCGA-3’；
（2）将得到的PCR产物进...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘勇，袁欣婕，黄昌军，李永平，于海芹，陈学军，肖炳光，
申请(专利权)人：云南省烟草农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：云南;53