本发明专利技术涉及一种氧化石墨烯-重组链球菌蛋白A复合物材料及其制备方法和应用。本申请利用氧化石墨烯的高比表面积的特性，通过共价结合的方法，将重组链球菌蛋白A固载到氧化石墨烯材料上，制备出具有抗体吸附生物活性的高容量抗体富集材料。制得的氧化石墨烯-重组链球菌蛋白A复合材料可用于抗体纯化、抗体富集、病原体检测、生物样品前处理等领域。
【技术实现步骤摘要】
【专利说明】氧化石墨烯-重组链球菌蛋白A复合材料及其制备方法和应用
本专利技术属于化学合成
，涉及石墨烯复合材料制备技术及其在蛋白质富集中的应用，具体的说是一种基于氧化石墨烯-重组链球菌蛋白A复合材料的制备及其功能化应用。
技术介绍
传染病病原体本身作为抗原在生物机体内可产生相应特异的抗体，现有检测方法多是通过抗原-抗体间的特异识别来检测病原体的，如酶联免疫吸附技术、免疫荧光和免疫胶体金技术等。这些免疫学技术具有操作简便，结果易于分析等特点，然而免疫学检测方法的灵敏度相对较低，易造成结果的假阴性。为了提高免疫学检测方法对传染病病原体的检测灵敏度，通常对样品进行富集。对样品进行有效的前处理，可提高待检测样品中抗体的浓度，从而间接提高检测方法的灵敏度。目前针对抗体富集的商品化试剂多以琼脂糖、海藻糖为载体固载吸附抗体的重组链球菌蛋白A，如琼脂糖固载Protein G约为80ug/mL，其固载蛋白量较低。因此研制对目标蛋白固载量大的载体，并通过有效固载重组链球菌蛋白A，对于实现抗体富集具有重要意义。石墨烯是一种仅有一个碳原子厚度的二维纳米材料，是碳原子以SP2杂化轨道组成的六角形蜂巢晶格的平面薄膜。2004年由Novoselov等用胶带层层剥离法从石墨中分离得到，其理论厚度仅为0.335 nm。单层石墨烯成为继碳纳米管之后的新型碳纳米材料，在物理、化学、材料、生物等众多领域掀起了巨大的研究热潮。石墨烯中无碳原子缺失，机械强度高、结构稳定、热稳定性好、化学稳定性高、比表面积大(2600 m2*g-l)，而且具有良好的生物相容性，使其容易吸附其他生物分子，特别是氧化石墨烯除拥有大比表面积外，在其表面还存在大量的含氧基团，使氧化石墨烯更适用于吸附拥有较多化学基团的生物分子，如蛋白质、核酸等。当石墨烯材料与其他材料相复合时，利用其他材料的相关性质，即可实现生物分子的富集。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术利用氧化石墨烯的高比表面积的特性，通过共价结合的方法，将重组链球菌蛋白A固载到氧化石墨烯材料上，制备出具有抗体吸附生物活性的高容量抗体富集材料。具体技术方案如下。本申请提供的氧化石墨烯-重组链球菌蛋白A复合材料为重组链球菌蛋白A(PA)与固载聚乙烯亚胺的氧化石墨烯的共价结合物，所述固载聚乙烯亚胺(PEI)的氧化石墨烯与重组链球菌蛋白A的质量数之比为1:1.5-2ο本申请中所述氧化石墨烯-重组链球菌蛋白A复合材料的制备方法包括如下步骤: 1)活化氧化石墨烯； 2)向I份活化的氧化石墨烯GO中加入15-30份聚乙烯亚胺(PEI)，室温震荡，离心后去上清，沉淀，即得固载PEI的氧化石墨烯材料(GOOPEI); 3)活化PA; 4)按照GOOPEI与活化的PA质量数之比为:1:1.5-2的比例，将上述GOOPEI与活化的PA，混合进行振荡孵育；离心后去上清，材料洗涤，所得材料即为氧化石墨烯-重组链球菌蛋白A复合材料(GO-PA)。进一步地，上述步骤I)中所述活化氧化石墨烯的具体步骤为:将GO重悬于去离子水中，室温超声将充分分散；按I份GO材料中同时加入15-25份N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和5-10份1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)混匀后进行活化；材料洗涤后，即得活化的氧化石墨烯G0。进一步地，上述步骤3)中所述重组链球菌蛋白A的活化过程为:将PA溶于2- (N-吗啉基)乙磺酸4-吗啉乙磺酸(MES)溶液中；按I份PA中同时加入3_5份N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和7-10份1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)混匀后进行活化，材料洗涤后，即得活化的PA。本申请提供的氧化石墨烯-重组链球菌蛋白A复合材料可以用在抗体纯化、抗体富集、病原体检测和/或生物样品前处理等领域中。本专利技术具有如下优点: 1.本专利技术了优化了氧化石墨烯材料对重组链球菌蛋白A的固载条件，保持了蛋白的活性，并且提高了蛋白的固载量； 2.该方法的制备步骤简便、易于推广、重现性好； 3.该方法制备氧化石墨烯-重组链球菌蛋白A复合材料易于大规模生产，成本低。【附图说明】图1.制备材料抗体吸附检测。【具体实施方式】下面结合实施例对本专利技术做进一步说明。实施例1 (一)氧化石墨烯(GO)的活化 1.1mg GO重悬于ImL的去离子水中，室温超声3h，充分分散； 2.加入500mM (pH6.1)MES 500 μ L，然后同时 30mg/ml NHS 500 μ L 和 10mg/ml EDC600uL,混匀，室温快速搅拌30min ； 3.材料用500mM(pH6.1) MES反复洗涤，除去残余的NHS和EDC，终体积为lmL。(二)将活化的氧化石墨烯材料进行PEI修饰 1.在上述材料中加入15mgPEI，室温震荡Ih ; 2.16400Xg/10min离心后去上清，沉淀即为GOOPEI。(三)重组链球菌蛋白A的活化 1.取500ug PA 溶于 500mM (pH6.1) MES ImL 中； 2.然后同时加入1.5mg NHS和3.5mg EDC混匀，快速搅拌30min ； 3.溶液即为活化的PA。(四)氧化石墨烯固载重组链球菌蛋白A 1.选择按照1:1.5的比例，将上述(二)制备的材料GOOPEI与(三)制备的活化的PA，混合进行4°C振荡过夜孵育； 2.16400Xg/10min离心后去上清，加入500mM (pH6.1)MES洗涤三次，所得材料即为氧化石墨烯-重组链球菌蛋白A (GO-PA)复合材料。(五)固载材料功能检测 将制备的GO-PA复合材料经牛血清白蛋白封闭后，与异硫氰酸荧光素(FITC)标记的免疫球蛋白A (IgA)孵育2h，通过倒置荧光显微镜观察，如图1所示，A图为白光场，不规则状物质即为GO-PA复合材料，B图为相应位置的绿色荧光场，在400倍视野下通过左右对比可见，GO-PA复合材料周边有明显的荧光表达，说明FITC标记的IgA被吸附在材料上，提示GO-PA复合材料上蛋白A的活性保持良好。实施例2 氧化石墨稀(GO)的活化方案中，NHS浓度改为50mg/ml，其他同实施例1，可制备得GO-PA复合材料。实施例3 氧化石墨稀(GO)的活化方案中，NHS浓度改为40mg/ml，其他同实施例1，可制备得GO-PA复合材料。实施例4 氧化石墨稀(GO)的活化方案中，EDC浓度改为20mg/ml，其他同实施例1，可制备得GO-PA复合材料。实施例5 氧化石墨稀(GO)的活化方案中，EDC浓度改为15mg/ml，其他同实施例1，可制备得GO-PA复合材料。实施例6 将活化的氧化石墨烯材料进行PEI修饰方案中，PEI调整为30mg，其他同实施例1，可制备得GO-PA复合材料。实施例7 将活化的氧化石墨烯材料进行PEI修饰方案中，PEI调整为20mg，其他同实施例1，可制备得GO-PA复合材料。实施例8 将活化的氧化石墨烯材料进行PEI修饰方案中，PEI调整为25mg，其他同实施例1，可制备得GO-PA复合材料。实施例9 重组链球菌蛋白A的活化方案中，NHS调整为2.5mg，其他同实施例1，可制备得GO-PA复合材料。实施例10本文档来自技高网...
【技术保护点】
氧化石墨烯‑重组链球菌蛋白A复合材料，其特征在于，所述复合材料为重组链球菌蛋白A与固载聚乙烯亚胺的氧化石墨烯的共价结合物，所述固载聚乙烯亚胺的氧化石墨烯与重组链球菌蛋白A的质量数之比为1：1.5‑2。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李云峰，
申请(专利权)人：李云峰，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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