具有提高的动态范围的测定制造技术

本文提供了可用于避免“前带现象”或“钩效应”并且扩大可精确测量的分析物浓度范围的测定和试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有提高的动态范围的测定相关申请的交叉引用本申请是2013年3月15日提交的美国申请号13/833,655的继续申请，该美国申请为了所有目的通过引用而全文并入本文。
本文提供了用于扩大测定的动态范围的试剂盒和方法。
技术介绍
在过去几十年中，已经使用荧光、化学发光或响应于分析物产生信号的其他手段进行了测定。目前，许多测定通过测量在反应混合物的总体积中产生的光信号的强度来进行。产生的光信号可以通过光学手段来测量，其中产生的光信号由大量分子发出。在典型的实施方案中，这些测定可以如下进行：将怀疑含有抗原的样品与包含附接至固体支持物(例如，微粒)上的第一抗体的试剂组合，以形成反应混合物。该抗原如果存在于样品中，则与该第一抗体特异性结合。向反应混合物中引入包含其上附接有标记的第二抗体的偶联物，并与所述抗原特异性结合，该抗原与第一抗体特异性结合，该第一抗体如前所述附接至固体支持物上。这样的测定被称为夹心测定或免疫计量测定。这种类型的测定示意性地示于图1中。在一般通过进行洗涤步骤从反应混合物中除去未结合的偶联物之后，测量由标记物引起的信号。测量来源于反应混合物的总体积的信号，然后将其与校准曲线进行比较，以确定样品中存在的抗原的浓度。当测定包括在引入偶联物抗体之前去除未结合的样品分析物的洗涤步骤时，它通常被认为是“两步测定”。当测定将偶联物抗体和分析物一起引入抗体包被的微粒而没有中间洗涤步骤时，它被认为是“一步”测定。“钩效应”或“前带现象”是当在“一步测定”形式中存在压倒性的量的抗原时，测定得到假低值的现象。这是由测定中捕获抗体和检测抗体不足引起的。这样的钩效应限制了测定的动态范围。夹心测定可以检测宽范围的分析物浓度；通常，它可准确地测量2-3个数量级的分析物浓度。但是，更宽地扩大分析物检测，例如超过3个数量级，是不常见的。
技术实现思路
在一个方面，本专利技术提供了试剂盒。在不同的实施方案中，该试剂盒包含：i)包含第一标记物的第一分析物结合分子；ii)包含第二标记物的第二分析物结合分子，其中第一分析物结合分子对分析物的结合亲和力大于第二分析物结合分子对分析物的结合亲和力，以及iii)附接至固体支持物上的第三分析物结合分子，其中第三分析物结合分子能够与第一分析物结合分子或第二分析物结合分子同时与分析物结合。在一些实施方案中，第一分析物结合分子和第二分析物结合分子直接附接至标记物。在一些实施方案中，第一分析物结合分子、第二分析物结合分子和/或第三分析物结合分子中的一个或多个是抗体或其片段。在一些实施方案中，该固体支持物选自颗粒、微粒、珠子、电极和多孔板。在一些实施方案中，该固体支持物包含两个或更多个空间上分离的电极。在一些实施方案中，该固体支持物包含微粒。在一些实施方案中，第一标记物和第二标记物之一或两者选自酶、发色团和荧光团。在一些实施方案中，第一标记物和第二标记物是不同的。在一些实施方案中，第一分析物结合分子和第二分析物结合分子对分析物的结合亲和力的差异在约5倍至约100倍，例如，约10倍至约100倍的范围内。在一些实施方案中，第一分析物结合分子和第二分析物结合分子对分析物的结合亲和力的差异为至少约100倍。在一些实施方案中，所述试剂盒可用于一步或两步夹心测定。在一些实施方案中，所述试剂盒包含：i)附接至第一固体支持物上的第一分析物结合分子；ii)附接至第二固体支持物上的第二分析物结合分子，其中第一分析物结合分子对分析物的结合亲和力大于第二分析物结合分子对分析物的结合亲和力；以及iii)包含标记物的第三分析物结合分子，其中第三分析物结合分子可与第一分析物结合分子或第二分析物结合分子同时与分析物结合。在一些实施方案中，第一分析物结合分子、第二分析物结合分子和/或第三分析物结合分子中的一个或多个是抗体或其片段。在一些实施方案中，第三分析物结合分子直接附接至标记物。在一些实施方案中，该标记物选自酶、发色团和荧光团。在一些实施方案中，第一固体支持物和第二固体支持物独立地选自颗粒、微粒、珠子、电极和多孔板。在一些实施方案中，第一固体支持物是包含第一发色团的微粒或珠子而第二固体支持物是包含第二发色团的微粒或珠子。在一些实施方案中，第一固体支持物和第二固体支持物是形状或大小不同的微粒。在一些实施方案中，第一固体支持物是第一电极而第二固体支持物是第二电极，其中第一电极和第二电极在空间上是分离的。在一些实施方案中，第一分析物结合分子和第二分析物结合分子对分析物的结合亲和力的差异在约5倍至约100倍，例如，约10倍至约100倍的范围内。在一些实施方案中，第一分析物结合分子和第二分析物结合分子对分析物的结合亲和力的差异为至少约100倍。在一些实施方案中，例如，对于竞争性测定试剂盒，该试剂盒包含：i)附接至第一固体支持物上的第一分析物结合分子；ii)附接至第二固体支持物上的第二分析物结合分子，其中第一分析物结合分子对分析物的结合亲和力大于第二分析物结合分子对分析物的结合亲和力；以及iii)包含附接至标记物的所述分析物或其片段的示踪剂，其中所述示踪剂可与所述分析物竞争结合第一分析物结合分子或第二分析物结合分子。在一些实施方案中，该试剂盒包含的第一分析物结合分子和/或第二分析物结合分子中的一个或多个为抗体或其片段。在一些实施方案中，所述标记物选自酶、发色团和荧光团。在一些实施方案中，第一固体支持物和第二固体支持物独立地选自颗粒、微粒、珠子、电极和多孔板。在一些实施方案中，第一固体支持物是包含第一发色团的微粒或珠子而第二固体支持物是包含第二发色团的微粒或珠子。在一些实施方案中，第一固体支持物和第二固体支持物是形状或大小不同的微粒。在一些实施方案中，第一固体支持物是第一电极而第二固体支持物是第二电极，其中第一电极和第二电极在空间上是分离的。在一些实施方案中，第一分析物结合分子和第二分析物结合分子对分析物的结合亲和力的差异在约5倍至约100倍，例如，约10倍至约100倍的范围内。在一些实施方案中，第一分析物结合分子和第二分析物结合分子对分析物的结合亲和力的差异为至少约100倍。在另一方面，本专利技术提供了扩大测定的动态范围的方法。在不同的实施方案中，该方法包括：a)使怀疑包含分析物的测试样品与包含第一标记物的第一分析物结合分子、包含第二标记物的第二分析物结合分子和附接至固体支持物上的第三分析物结合分子在允许以下结合的条件下接触：(i)第一分析物结合分子和第三分析物结合分子，以及(ii)第二分析物结合分子和第三分析物结合分子与分析物的结合，其中第一分析物结合分子对分析物的结合亲和力大于第二分析物结合分子对分析物的结合亲和力，其中第一分析物结合分子和第二分析物结合分子不同时与分析物结合；b)测量与分析物结合的第一分析物结合分子的第一标记物以及与分析物结合的第二分析物结合分子的第二标记物的信号强度；以及c)通过比较第一标记物和第二标记物的信号强度来确定分析物的浓度。在一些实施方案中，第一分析物结合分子、第二分析物结合分子和/或第三分析物结合分子中的一个或多个是抗体或其片段。在一些实施方案中，第一分析物结合分子和第二分析物结合分子直接附接至标记物。在一些实施方案中，该固体支持物选自颗粒、微粒、珠子、电极和多孔板。在一些实施方案中，第一标记物和第二标记物本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种试剂盒，其包含：i)包含第一标记物的第一分析物结合分子；ii)包含第二标记物的第二分析物结合分子，其中第一分析物结合分子对分析物的结合亲和力大于第二分析物结合分子对分析物的结合亲和力，以及iii)附接至固体支持物上的第三分析物结合分子，其中第三分析物结合分子能够与第一分析物结合分子或第二分析物结合分子同时与分析物结合。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.03.15 US 13/833,6551.一种试剂盒，其包含：i)包含第一标记物的第一分析物结合分子；ii)包含第二标记物的第二分析物结合分子，其中第一分析物结合分子对分析物的结合亲和力大于第二分析物结合分子对分析物的结合亲和力，以及iii)附接至固体支持物上的第三分析物结合分子，其中第三分析物结合分子能够与第一分析物结合分子或第二分析物结合分子同时与分析物结合，其中所述固体支持物包含两个或更多个空间上分离的电极，其中所述固体支持物包含在手持式照护点装置中。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中第一分析物结合分子、第二分析物结合分子和/或第三分析物结合分子中的一个或多个是抗体或其片段。3.根据权利要求1至2中任意一项所述的试剂盒，其中第一分析物结合分子和第二分析物结合分子直接附接至标记物。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其中所述固体支持物选自颗粒、微粒、珠子、电极和多孔板。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其中所述固体支持物包含微粒。6.根据权利要求1所述的试剂盒，其中第一标记物和第二标记物之一或两者选自酶、发色团和荧光团。7.根据权利要求1所述的试剂盒，其中第一标记物和第二标记物是不同的。8.根据权利要求1所述的试剂盒，其中第一分析物结合分子和第二分析物结合分子对分析物的结合亲和力的差异在约5倍至约100倍的范围内。9.根据权利要求1所述的试剂盒，其中第一分析物结合分子和第二分析物结合分子对分析物的结合亲和力的差异为至少约100倍。10.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述试剂盒能用于一步夹心测定。11.一种扩大测定的动态范围的方法，其包括：a)使怀疑包含分析物的测试样品与包含第一标记物的第一分析物结合分子、包含第二标记物的第二分析物结合分子和附接至固体支持物上的第三分析物结合分子在允许以下结合的条件下接触：(i)第一分析物结合分子和第三分析物结合分子，以及(i)第二分析物结合分子和第三分析物结合分子，与所述分析物的结合，其中第一分析物结合分子对分析物的结合亲和力大于第二分析物结合分子对分析物的结合亲和力，其中第一分析物结合分子和第二分析物结合分子不同时与所述分析物结合；b)测量与分析物结合的第一分析物结合分子的第一标记物以及与分析物结合的第二分析物结合分子的第二标记物的信号强度；以及c)通过比较第一标记物和第二标记物的信号强度确定分析物的浓度，其中测量与分析物结合的第一分析物结合分子的第一标记物的信号强度和与分析物结合的第二分析物结合分子的第二标记物的信号强度的步骤b)在分析物浓度的预定范围上在校准测定中完成，并且所述方法进一步包括以下步骤：d)通过在提供与分析物结合的第一分析物结合分子的第一标记物的最大信号强度的分析物浓度之处或附近，确定校准测定中与该分析物结合的第一分析物结合分子的第一标记物的信号强度同与该分析物结合的第二分析物结合分子的第二标记物的信号强度之比值或该比值的倒数，来建立旗标值。12.根据权利要求11所述的方法，其中第一分析物结合分子、第二分析物结合分子和/或第三分析物结合分子中的一个或多个是抗体或其片段。13.根据权利要求11所述的方法，其中第一分析物结合分子和第二分析物结合分子直接附接至标记物。14.根据权利要求11所述的方法，其中所述固体支持物选自颗粒、微粒、珠子、电极和多孔板。15.根据权利要求11所述的方法，其中第一标记物和第二标记物之一或两者选自酶、发色团和荧光团。16.根据权利要求11所述的方法，其中第一分析物结合分子和第二分析物结合分子与测试样品在同一反应混合物中接触。17.根据权利要求11所述的方法，其中第一分析物结合分子和第二分析物结合分子与测试样品在不同的反应混合物中接触。18.根据权利要求17所述的方法，其中第一标记物和第二标记物是相同的。19.根据权利要求11所述的方法，其中第一标记物和第二标记物是不同的。20.根据权利要求11所述的方法，其中第一分析物结合分子和第二分析物结合分子对分析物的结合亲和力的差异在约5倍至约100倍的范围内。21.根据权利要求11所述的方法，其中第一分析物结合分子和第二分析物结合分子对分析物的结合亲和力的差异为至少约100倍。22.根据权利要求11所述的方法，其中所述测定的动态范围包括三个或更多个数量级。23.根据权利要求11所述的方法，其中第一分析物结合分子和第二分析物结合分子以相差不到约100倍的预定摩尔量存在。24.根据权利要求11所述的方法，其中第一分析物结合分子和第二分析物结合分子未寡聚化或交联。25.根据权利要求11所述的方法，其中当与测试样品中的分析物结合的第二分析物结合分子的第二标记物的信号强度同与该分析物结合的第一分析物结合分子的第一标记物的信号强度之比：超过或等于所述旗标值时，从与该分析物结合的第一分析物结合分子的第一标记物的信号强度获得的校准曲线的下降段用来确定分析物浓度；或者小于所述旗标值时，从与该分析物结合的第一分析物结合分子的第一标记物的信号强度获得的校准曲线的上升段用来确定分析物浓度。26.根据权利要求11所述的方法，其中当与测试样品中的分析物结合的第一分析物结合分子的第一标记物的信号强度同与该分析物结合的第二分析物结合分子的第二标记物的信号强度之比：小于或等于所述旗标值时，从与该分析物结合的第一分析物结合分子的第一标记物获得的信号强度的校准曲线的下降段用来确定分析物浓度；或者超过所述旗标值时，从与该分析物结合的第一分析物结合分子的第一标记物的信号强度获得的校准曲线的上升段用来确定分析物浓度。27.根据权利要求11所述的方法，其中所述方法使用自动化或半自动化系统来进行。28.根据权利要求11所述的方法，其中所述测定是一步测定。29.一种试剂盒，其包含：i)附接至第一固体支持物上的第一分析物结合分子；ii)附接至第二固体支持物上的第二分析物结合分子，其中第一分析物结合分子对分析物的结合亲和力大于第二分析物结合分子对分析物的结合亲和力；以及iii)包含标记物的第三分析物结合分子，其中第三分析物结合分子能与第一分析物结合分子或第二分析物结合分子同时与分析物结合。30.根据权利要求29所述的试剂盒，其中第一分析物结合分子、第二分析物结合分子和/或第三分析物结合分子中的一个或多个是抗体或其片段。31.根据权利要求29所述的试剂盒，其中第三分析物结合分子直接附接至所述标记物。32.根据权利要求29所述的试剂盒，其中所述标记物选自酶、发色团和荧光团。3...

【专利技术属性】
技术研发人员：B·L·杜维尔，S·给达，Q·阮，J·P·斯金纳，S·Y·特亭，
申请(专利权)人：雅培实验室，
类型：发明
国别省市：美国;US