本发明专利技术涉及一种基于比色分析的免疫传感器的制备方法及应用，属于新型功能材料，新型传感器构建技术领域。基于抗原抗体之间良好的特异性，以及显色复合物对过氧化氢的快速响应，显著提高了传感器的灵敏度，降低了传感器的检出限，可以实现对肿瘤标志物的实时在线检测，对肿瘤的早期诊断具有重要的意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种比色传感分析免疫传感器的制备方法及应用。具体是采用自制ITO传感平台构建了一种检测肿瘤标志物的比色传感器，属于新型生物传感检测
技术介绍
甲胎蛋白是一种常见的抗原。在甲胎蛋白的产生过程中，可能伴随着人体某些器官组织的病变，通常表现为肝癌、胰腺癌、肠胃管肿瘤等等。因此，在临床研究上，发展一种快速、简便、灵敏的检测甲胎蛋白的方法是十分重要的。比色分析免疫传感器具有灵敏度高、可视化检测、操作简便、小型化、快速准确检测分析等优点，因此本专利技术制备了一种基于显色复合物的比色传感器，实现了对甲胎蛋白的检测。目前已有的甲胎蛋白的临床检测方法很多，如放射免疫分析、化学发光免疫分析、酶联免疫分析等。比色传感分析是将免疫学方法与可视化比色方法相结合的一种生物传感器，通过抗原与抗体之间的特性性结合，使得它具有高灵敏性、高选择性、分析快速和实时监测等优点。本专利技术采用显色复合物APTMS-GA为基底材料，利用夹心型的模式构建比色传感器，二抗标记物为Ab@Au_-Ti02@G0x，实现了其对甲胎蛋白的成功固定，增强了传感器的灵敏度，扩宽了线性范围，有效地降低了传感器的检出限，并可以实现随时随地方便检测。该方法具有灵敏度高、特异性好、检测快速等优点，而且实现了实施检测，且不需要借助大型仪器，有效降低了传感器的制作及检测成本，有效克服了目前甲胎蛋白检测方法的不足。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是基于显色复合物APTMS-GA为基底材料，构建了一种可以实时监测的比色免疫传感器。本专利技术的目的之二就是将六11_-1102用于孵化抗体，实现了甲胎蛋白的高灵敏检测。本专利技术的目的之三就是可以将该比色免疫传感器用于随时随地的实时检测，达到灵敏监测的效果。 本专利技术的技术方案如下:1.一种基于比色分析的免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:(1)用质量分数为0.1%~10%的3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES的甲醇溶液浸泡3 mm X3mm的ITO玻璃24 h，取出后洗涤； (2)在ITO玻璃上滴加6μ?、3-氨丙基三甲氧基硅烷-戊二醛显色复合物APTMS_GA，4°C冰箱中晾干； (3)继续滴加6μ?、1 μδΜ~100 Pg/mL的甲胎蛋白抗体Ab，4 °C冰箱中晾干，超纯水冲洗，再于4 °C冰箱中晾干； (4)继续滴加6PL、质量分数为0.1%~2%的BSA溶液，封闭玻璃表面上非特异性活性位点，4 °C冰箱中晾干； (5)继续滴加6μ?、0.0OOl ng/mL~50 ng/mL的一系列不同浓度的甲胎蛋白抗原标准溶液到ITO玻璃上，超纯水冲洗，4 °C冰箱中晾干； (6)继续滴加6μ?的抗体孵化物AbOAuON-T12OGOxS液，4 ° C冰箱中晾干，超纯水洗涤，4 °C冰箱中晾干； (7)继续滴加6μ?、1~100 mmol/L的葡萄糖溶液，充分反应； (8)将修饰好的ITO依次放入微孔板中，4° C冰箱中晾干，制得比色免疫传感器。2.如权利要求1所述的一种基于比色分析的免疫传感器的制备方法，所述的抗体孵化物AbOAuON-T12OGOx溶液，制备步骤如下: (1)金纳米粒子的制备 取1~3 mL、质量分数为1%的HAuCl4溶液，用高纯水稀释至100~200 mL，磁力搅拌，沸腾后加入1~15 mL、质量分数为1%的柠檬酸钠，煮沸至酒红色不再改变，继续加热5 min，室温冷却，制得金纳米粒子； (2)负载标记物的N-T12材料的制备 向锥形瓶中加入30 mL、质量分数为99.5%的乙醇溶液，继续加入0.1-1.0 g尿素，搅拌；向试管中加入0.1-2.5 g的酞酸丁酯Ti (OBu) 4,430 μ?、质量分数为37%的盐酸；待试管中溶液混合均匀后，将试管中的混合液缓慢加入到尿素溶液中，溶液变成乳白色，搅拌14h;将溶液转移到反应釜中，130 °C条件下加热1~10 h，反应釜冷却后，将固体用乙醇洗涤，离心2次，在烘箱中干燥4~10 h，将干燥后的白色固体用研钵研磨成粉末，放入瓷舟内，在200-600 °C灼烧2 h，冷却后得到11102材料； (3 ) AuiN-T i 02复合材料的制备 M 0.1-2 g N-T12M料加入50 HiL无水乙醇，加热到70° C，快速逐滴加入500 μ?的3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES，70°C反应3~10 h，将得到的白色溶液离心，制得氨基化N-T12,将氨基化11102与AuNPs混合并离心，直至所加Au纳米溶胶不再变色；将固体干燥，研磨，制得AuON-T12复合材料； (4)抗体孵化物AbOAuON-T12OGOx溶液的制备 将I?5 mg的AuON-T12加入到2 mL水中，并加入400 μ?Λ Pg/mL?100 Pg/mL的甲胎蛋白抗体Ab溶液和0.1-5 mg的葡萄糖氧化酶G0X，充分混匀，震荡24 h，制得抗体孵化物AbiAuiN-T i O2OGOx 溶液。3.如权利要求1所述的一种基于比色分析的免疫传感器的制备方法，所述的显色复合物APTMS-GA，其特征在于，制备步骤如下: 将质量分数为0.5%~10%的3-氨丙基三甲氧基硅烷APTMS和质量分数为0.2%~5%的戊二醛GA按照1:1比例进行混合，制得砖红色的APTMS-GA标记物。4.如权利要求1所述的制备方法制备的一种基于比色分析的化学免疫传感器，用于甲胎蛋白的检测，检测步骤如下: 待微孔板中的ITO显色板在室温下充分反应后，在相同的光照强度下对每一块ITO拍照，用Image J软件计算每一块玻璃的灰度，得到平均灰度与抗原浓度曲线；按照工作曲线的方法对样品进行测定，依据工作曲线计算甲胎蛋白含量。 本专利技术的有益成果 (I)显色复合物APTMS-GA是良好的显色剂，对过氧化氢的响应十分灵敏，通过葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖产出过氧化氢，从而使显色复合物APTMS-GA褪色，来进行对癌胚抗原的定量检测。(2) ITO的使用，代替了传统的电极修饰传感器，达到了方便检测的效果，并且ITO价格低廉，且一次性使用，使传感器拥有良好的重现性。(3)六11_-1102介孔材料的使用，使检测抗体的标记层可以大量吸附葡萄糖氧化酶，从而使得传感信号得以成倍放大，实现了对癌胚抗原的超灵敏检测。(4)本专利技术利用抗原、抗体的免疫反应，提高了检测方法的特异性。(5)本专利技术利用简易拍照设备，对比色传感芯片进行拍照，通过Image J软件进行灰度拟合，实现灵敏检测。设备简单，操作快速，适合医疗条件不好的农村地区进行疾病的提前预防。(6)本专利技术制备的比色免疫传感器用于癌胚抗原的检测，响应时间短，检测限低，线性范围宽，可以实现简单、快速、高灵敏和特异性检测，其检测限达3 pg/mL。【具体实施方式】实施例1 一种基于比色分的免疫传感器的制备 (1)用质量分数为0.1%的3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES的甲醇溶液浸泡3 mm X 3mm的ITO玻璃24 h，取出后洗涤； (2)在ITO玻璃上滴加6μ?、3-氨丙基三甲氧基硅烷-戊二醛显色复合物APTMS_GA，4°C冰箱中晾干； (3)继续滴加6μ?、1 Pg/mL的甲胎蛋白抗体Ab，4 °C冰箱中晾干，超纯水本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于比色分析的免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）用质量分数为0.1%~10%的3‑氨丙基三乙氧基硅烷APTES的甲醇溶液浸泡3 mm × 3 mm的ITO玻璃24 h，取出后洗涤；（2）在ITO玻璃上滴加6 µL、3‑氨丙基三甲氧基硅烷‑戊二醛显色复合物APTMS‑GA，4 ºC冰箱中晾干；（3）继续滴加6 µL、1 µg/mL~100 µg/mL的甲胎蛋白抗体Ab，4 ºC冰箱中晾干，超纯水冲洗，再于4 ºC冰箱中晾干；（4）继续滴加6 µL、质量分数为0.1%~2%的BSA溶液，封闭玻璃表面上非特异性活性位点，4 ºC冰箱中晾干；（5）继续滴加6 µL、0.0001 ng/mL~50 ng/mL的一系列不同浓度的甲胎蛋白抗原标准溶液到ITO玻璃上，超纯水冲洗，4 ºC冰箱中晾干；（6）继续滴加6 µL的抗体孵化物Ab@Au@N‑TiO2@GOx溶液，4 ºC冰箱中晾干，超纯水洗涤，4 ºC冰箱中晾干；（7）继续滴加6 µL、1~100 mmol/L的葡萄糖溶液，充分反应；（8）将修饰好的ITO依次放入微孔板中， 4 ºC冰箱中晾干，制得比色免疫传感器。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：于思琦，魏琴，任祥，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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