本发明专利技术公开了一种快速高效的曼陀罗原生质体制备方法，属于植物细胞工程领域。本发明专利技术利用茎尖组织培养技术获得了无菌的曼陀罗组培苗，以曼陀罗组培苗的幼叶为起始材料，采用纤维素酶(Cellulase)R10和离析酶(Macerozyme)R10，对曼陀罗幼叶组织进行酶解消化，并利用蔗糖密度梯度离心方法分离获得高质量的曼陀罗原生质体，产量高达1.4×106个/克。分离得到的原生质体富含叶绿体，且细胞膜完整，绝大多数呈球形，具有较高活力，能满足后续各种研究需要。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，属于植物细胞工程领域。
技术介绍
曼陀罗（Datura stramonium L )是前科曼陀罗属植物，广泛分布于世界各 大洲，我国各省份都有分布。据《全国中草药汇编》记载，其花做中药洋金花入药。曼 陀罗全株有毒，其毒性成分，亦是其主要药效物质成分，是莨菪碱和东莨菪碱类化合 物，主要起镇痉、镇静、镇痛和麻醉作用。东莨菪碱的解痉麻醉作用强于莨菪碱，而在 曼陀罗植物体内，莨菪碱占主导地位，仅含有少量东莨菪碱（Elisabetta Miraldia，et al.Distribution of hyoscyamine and scopolamine in Datura stramonium. Fitoterapia，2001，72:644-648.) 〇 原生质体是指去除细胞壁后的裸露细胞，具有该细胞的所有生命特征，是进行基 础研究的理想材料，被广泛应用于基因转化、蛋白表达等研究。通过原生质体进行叶绿体基 因转化，达到叶绿体生物反应器的目的，是目前的研究热点之一。通过叶绿体转基因技术， 将曼陀罗植物体内的莨菪碱转化成活性更高的东莨菪，是药学工作者的兴趣之一。在以曼 陀罗为材料的研究中，至今尚未有以曼陀罗原生质体为介质进行叶绿体基因转化的报道。 而在曼陀罗原生质体制备的研究中，往往通过诱导愈伤组织，从愈伤组织中分离纯化得到 原生质体（黄静，等.曼陀罗茎段愈伤组织诱导和再生植株的研究.生物技术通报，2007， 5:179~183;蔡起贵，等.曼陀罗愈伤组织的原生质体再生植株.中国植物学会五十周年 年会学术报告及论文摘要汇编，1983 :554.)，操作复杂，耗时较长，急需一种快速高效的曼 陀罗原生质体制备方法，以满足后续研究需求。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种快速、高效且适合曼陀罗叶绿体基因转化的原生质体制 备方法。 本专利技术的技术方案是： 本专利技术提供了一种曼陀罗原生质体制备方法，利用茎尖组织培养技术获得了无菌 的曼陀罗组培苗，以曼陀罗组培苗的幼叶为起始材料，采用纤维素酶（Cellulase)RlO和离 析酶（Macerozyme) R10,对曼陀罗幼叶组织进行酶解消化，并利用鹿糖密度梯度离心方法分 离获得曼陀罗原生质体。 所述的茎尖组织培养技术，为本领域常规技术，可参见文献：罗士苇，植物组织培 养，植物生理学通报，1957, 5 :16~25 ; 所述的纤维素酶RlO溶液，优选终浓度为0. 25% (g/mL); 所述的离析酶RlO溶液，优选终浓度为0. 25% (g/mL); 所述的蔗糖密度梯度离心方法，是指用于曼陀罗原生质体酶解的溶液中蔗糖含量 高于用于曼陀罗原生质体分离的溶液中蔗糖含量。即根据溶液A与溶液B中蔗糖含量不同， 造成溶液A密度大于溶液B，而酶解后的曼陀罗原生质体的密度，刚好处于溶液A与溶液B 之间。通过离心，能使完整的原生质体处于溶液A和溶液B的界面之间，破碎的细胞沉到溶 液A底部，其他一些低密度物质悬浮于溶液B中，其中溶液A和溶液B的配方见表1。 本专利技术所述的一种曼陀罗原生质体制备方法，具体的步骤如下： (a)曼陀罗茎尖培养：剪取曼陀罗栽培苗的茎尖带幼芽部位，消毒后转移至MS培 养基中。 (b)曼陀罗组培苗培养：将步骤（a)的消毒茎尖在MS培养基上培养3~5周，直 至其长出展开的叶片。培养条件：22~28°C，光照14~18h，优选25°C，光照16h。 (c)原生质体酶解：在一 9cm直径的细胞培养皿中，加入20mL溶液A ;剪取5~7 片步骤（b)组培苗展开的幼叶，快速用剪刀剪成Imm的条状，置于溶液A中，于25°C暗中静 置培养2~3h后，用移液器弃溶液A，置换20mL新的溶液A，分别加入10% (g/mL)浓度的 纤维素酶RlO溶液和10% (g/mL)浓度的离析酶RlO溶液各500 μ L，置于水平摇床中，于 22~28°C (优选25°C )黑暗条件下，以55~60rpm的转速过夜（约12~16h)。 (d)原生质体分离：用70 μ m细胞筛网过滤步骤（c)的酶解液至无菌的50mL离心 管中，并用20mL溶液A冲洗筛网上的叶片残渣，然后用移液器在滤液上层缓慢滴加 IOmL溶 液B，避免与溶液A混溶。25°C下用100g离心力（RCF)离心15min，用无菌吸管吸取溶液A 和溶液B之间的原生质体，即得到所需的原生质体。 (e)原生质体悬浮：将步骤（d)分离的原生质体悬浮在溶液B中。 (f)原生质体计数：将步骤（e)中的原生质体颠倒混匀，用移液器吸取20 μ L滴于 血球计数板上，于倒置显微镜下计数，根据参与酶解的叶片多少计算出每克叶片得到的原 生质体产量，计算结果用每克叶片原生质体数表示（个/g)。 其中步骤（a)中所述的消毒方法如下：莖尖组织用体积百分比为75%的乙醇浸泡 lOmin，灭菌蒸馏水冲洗5次，再用体积百分比为10%的次氯酸钠溶液浸泡lOmin，灭菌蒸馏 水冲洗5次。 其中步骤（a)和（b)中所述的MS培养基配制如下：将4. 43g MS培养基粉末与30g 蔗糖溶解于IL蒸馏水中，用IM KOH溶液调整pH值至5. 8后，加入7. 5g琼脂，加热溶解，趁 热分装45~55mL至300mL组培罐中，121°C湿热灭菌25min。 所述的10 % (g/mL)纤维素酶RlO溶液的配制方法如下：称取Ig纤维素酶RlO 粉末和1.37g蔗糖溶于IOmL蒸馏水中，用0.22μπι微孔滤膜过滤除菌，250 yL分装保存 于-20。。。 所述的10% (g/mL)离析酶RlO溶液的配制方法如下：称取Ig离析酶RlO粉末和 I. 37g蔗糖溶于IOmL蒸馏水中，用0. 22 μ m微孔滤膜过滤除菌，250 μ L分装保存于-20°C。 所述的溶液A和溶液B的组成成分如表1所示，且溶液A和溶液B均需用IM KOH 溶液调整pH值至5. 8,并用0. 22 μ m微孔滤膜过滤除菌。 表1溶液A和溶液B的试剂组成 所述的6-BA溶液的配制方法如下：称取1.0 mg 6-BA粉末，先用50 μ L IM KOH溶 液溶解，再用950 μ L蒸馏水稀释成lmg/mL浓度。 所述的NAA溶液的配制方法如下：称取1.0 mg NAA粉末，先用25 μ L IM KOH溶液 溶解，再用975 μ L蒸馏水稀释成lmg/mL浓度。 所述的微量无机盐溶液100 X的配制方法如下：称取0. 0025g CuSO4 · 5H20， 0. 0025g CoCl2,0.025g Na2MoO4 ·2Η20,0. 083g ΚΙ,Ο. 620g H3BO3,0.860g ZnSO4 ·7Η20, 2. 23g MnSO4 · H2O和4g NaEDTA，用蒸馏水溶解并定容至1L，4°C保存。 所述的IM琥珀酸铵溶液的配制方法如下：称取23. 6g琥珀酸（丁二酸）和10. 6g NH4C1，加入IOOmL蒸馏水，快速小心加入22. 4g KOH固体并不断搅拌，待固体物质溶解后， 用蒸馏水定容至200mL，4°C保存。 所述的维生素盐溶液100X的配制方法如下：称取0. 002g d(+)-生物素，0. 100g 盐酸硫胺素（维生素 BI)，0. 200g盐酸吡哆醇（维生本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种曼陀罗原生质体制备方法，其特征在于，利用茎尖组织培养技术获得了无菌的曼陀罗组培苗，以曼陀罗组培苗的幼叶为起始材料，采用纤维素酶R10和离析酶R10，对曼陀罗幼叶组织进行酶解消化，并利用蔗糖密度梯度离心方法分离获得曼陀罗原生质体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李卿，陈万生，肖玲，陈军峰，谭何新，肖莹，张磊，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。