本发明专利技术涉及一种诱导三孢布拉氏霉老化菌株快速大量产孢的方法，包括如下步骤：(1)在培养皿中装入半固体培养基，将三孢布拉霉菌老化菌株的菌丝接种于半固体培养基中，在相对湿度为80-95%、空气流量为0.5 L/min的黑暗环境中，先于25-30℃下培养24-48h，再于10-20℃下培养12-24 h，培养基平板上长出孢子或菌丝；(2)将所得孢子或菌丝收集划线于另一新半固体培养基平板上，在步骤(1)所述环境参数和时间下培养；(3)重复步骤(2)所述操作，培养1-5代菌丝，挑取或收集孢子，即可得到大量孢子。本发明专利技术所述的方法产孢量多、产孢速度快，有效解决了三孢布拉霉菌（尤其是负菌）培养过程中不产或少产孢子的问题。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于农用微生物
，涉及及所得孢子在三孢布拉氏霉菌株分离和选育上的应用。
技术介绍
番茄红素是一种脂溶性类胡萝卜素，具有良好的抗氧化、抗肿瘤功效，且对肿瘤的预防、心血管的保护、维持免疫细胞的完整性有一定作用，因此备受众多研究者关注。番茄红素的主要获取方式有提取法、化学合成法和生物合成法。其中生物合成法是一种最有前景的获取番茄红素的方式，三孢布拉霉菌发酵生产番茄红素具有发酵单位效价高、环境友好、绿色天然、生产不受季节影响等优点，因而被广泛用于工业化发酵生产番茄素。但三孢布拉霉菌存在老化速度快、优良生产性状易丢失、保存菌株性状难恢复等缺点给工业化生产带来困难，发酵生产中需要不断地对菌株持续进行优化选育。三孢布拉霉菌菌丝为一种多核无横隔菌丝，其存在的等位基因可掩盖基因的正突变，故以单核孢子悬液为载体的选育方式成为最佳选择。三孢布拉霉菌(尤其是负菌)老化速度较快，菌丝老化后，其生命力衰退，色素分泌增加，细胞中空泡增多，甚至破裂。老化的菌种接入培养料后表现为菌丝生长慢、抵抗杂菌能力弱、产孢能力降低，给菌种的分离纯化和优化选育带来困难，因此迫切需要掌握三孢布拉霉菌老化菌株的大量产孢技术。华中科技大学张阳(三孢布拉霉大量产孢条件及发酵动力学研究，2013，8-21.)在250 ml的锥形瓶中分装60 ml的PDA培养基，以孢子悬液的方式接种，每个锥形瓶的接种量为I ml，接种后置于28°C恒温摇床静置培养20-24 h，然后置于20°C恒温摇床静置培养6 d，整个培养过程历时7d，培养时间过长，不适于工业化生产。
技术实现思路
本专利技术提供了一种诱导三孢布拉霉正、负菌的老化菌株快速大量产生孢子的方法，为三孢布拉霉菌菌种的优化选育提供简便而必备的前提条件。本专利技术是通过如下技术方案实现的: 本专利技术所采用菌种，三孢布拉氏霉菌(Blakeslea trisporazustl+)、三孢布拉氏霉菌(Blakeslea trisporazustl-)(浙江汇能动物药品有限公司微生物发酵实验室保藏)，该菌种具有代表性。具体操作方法为: (I)在培养皿中装入半固体培养基，将三孢布拉霉菌老化菌株的菌丝接种于半固体培养基中，在相对湿度为80-95%、空气流量为0.5 L/min的黑暗环境中，先于25_30°C下培养24-48h，再于10-20°C下培养12-24 h，培养基平板上长出孢子或菌丝；三孢布拉霉菌的接种方式有菌饼、菌丝体、孢子液三种方式，采用菌饼的接种方式，产孢量较低，菌丝体的接种方式产孢量高且操作简便。水分是控制三孢布拉霉孢囊孢子萌发的关键因素，湿度越大越有利于孢囊孢子的萌发；当湿度超过95%时，染菌几率增高，同时因细胞渗透压的影响，孢子反而不易形成。由于生物的应激效应，高温转低温的培养方法更有利于孢子的产生。三孢布拉氏霉菌是好氧微生物，氧气供应充足可以提高细胞的生长。然而，三孢布拉霉交织生长的菌丝使氧气在培养基中的含量降低，因此培养过程中要保持一定的空气流量，同时采用培养皿作为三孢布拉霉菌的培养器皿，相比三角瓶，可以增加三孢布拉霉菌与氧气的接触面积，增大其产孢量。(2)将所得孢子或菌丝收集划线于另一新半固体培养基平板上，在步骤(I)所述环境参数下培养； (3)重复步骤(2)所述操作，培养1-5代菌丝，挑取或收集孢子，即可得到大量孢子，即可得到大量孢子，菌丝的培养代次数量与菌株老化程度有关。步骤(I)中所述半固体培养基配方为:麦芽浸膏5-40 g/L，酵母蛋白胨5-20g/L，小分子羧酸盐 1-20 g/L, CuSO4.5H20 1-10 mg/L，FeCl3.6H20 10-500 mg/L，Co (NO3)2.6H20 l-10mg/L，琼脂粉15_20g/L，所述培养基的pH为5.5-7.5。蛋白胨富含有机氮化合物，能为微生物提供C源、N源、生长因子等营养物质。小分子羧酸盐可以为三孢布拉霉菌提供氮源，用于形成孢子的结构蛋白和mRNA分钟以及孢子形成所需的一些相关酶，其适当的用量可以诱导三孢布拉霉子囊孢子产生，但是过量的小分子羧酸盐和蛋白胨反而会抑制三孢布拉霉子囊孢子的产生。CuSO4.5H20可以作为一些酶类的激活剂，在其适当浓度时可能对三孢布拉霉菌株产孢过程的相关酶有激活作用，从而促进菌株产孢，但当CuSO4.5H20用量较大时，反而会导致菌株产孢量降低。FeCl3.6H20和Co (NO3)2.6H20均为三孢布拉霉孢子的形成提供了微量元素，其用量适当时对孢布拉霉菌株产孢有明显促进作用，当超过最佳用量时，菌株产孢量反而会下降。三孢布拉霉菌株的产孢需要适宜的PH条件，偏酸或者偏碱性的培养基均会导致产孢量降低，对菌株的代谢活动产生影响。作为优选，步骤(I)所述相对湿度为85%，培养时间为:先于27°C下培养44 h，再于15°C培养16 h。作为优选，所述半固体培养基配方为:麦芽浸膏20 g/L，酵母蛋白胨10g/L，小分子羧酸盐 3 g/L, CuSO4.5H20 7 mg/L, FeCl3.6H20 250 mg/L, Co (NO3) 2.6H20 4 mg/L,琼脂粉18g/L，所述培养基的pH为7。作为优选，步骤(I)中所述平板培养基厚度为1.5-1.9_。作为优选，所述小分子羧酸盐为丙酸盐、乙酸盐或乳酸盐中的一种。本专利技术还涉及老化菌株所产孢子在菌株分离纯化及菌种选育方面的应用，具体操作方法为:在无菌条件下，将所得孢子和菌丝混合物用无菌生理盐水冲洗并收集，再采用4层擦镜纸过滤，将滤液收集于三角瓶中，稀释得孢子悬液，将浓度为15-1O6个/mL的孢子悬液用于诱变处理，将浓度为16-1O8个/mL的孢子悬液平板涂布，用于菌种的分离纯化。本专利技术的有益效果为: 1、本专利技术所采用的培养基配方简单、原料廉价易得，对菌株培养环境要求简单、常规，易于操作控制，适于工业化生产。2、产孢量多、产孢速度快，有效解决了三孢布拉霉菌(尤其是负菌)培养过程中不产或少产孢子的问题。3、所生产孢子可用于三孢布拉霉菌菌株的分离纯化和菌种优化选育，对接种方式优化、单位效价提高、防止菌株过快老化等具有重要意义。说明书附图 图1为产孢前的负菌孢子； 图2为产孢后的负菌孢子； 图3为产孢前的正菌孢子； 图4为产孢后的正菌孢子。具体实施例下面结合具体实验实施例对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术不受实施例限制。实施例1:三孢布拉霉菌老化菌株产生大量孢子 (I)按如下配方配制半固体培养基:麦芽浸膏20g/L，酵母蛋白胨10g/L，丙酸盐3g/L，CuSO4 ■ 5H20 7 m当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种诱导三孢布拉氏霉老化菌株快速大量产孢的方法，其特征在于，所述诱导方法包括如下步骤：(1) 在培养皿中装入半固体培养基，将三孢布拉霉菌老化菌株的菌丝接种于半固体培养基中，在相对湿度为80‑95%、空气流量为0.5 L/min的黑暗环境中，先于25‑30℃下培养24‑48h，再于10‑20℃下培养12‑24 h，培养基平板上长出孢子或菌丝；(2) 将所得孢子或菌丝收集划线于另一新半固体培养基平板上，在步骤(1)所述环境参数和时间下培养；(3) 重复步骤(2)所述操作，培养1‑5代菌丝，挑取或收集孢子，即可得到大量孢子；步骤(1)中所述半固体培养基配方为：麦芽浸膏 5‑40 g/L，酵母蛋白胨 5‑20 g/L，小分子羧酸盐1‑20 g/L，CuSO4·5H2O 1‑10 mg/L，FeCl3·6H2O 10‑500 mg/L， Co(NO3)2·6H2O 1‑10mg/L，琼脂粉15‑20g/L，所述培养基的pH为5.5‑7.5。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈贵才，侯保兵，聂月美，王丽，
申请(专利权)人：浙江汇能动物药品有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。