本发明专利技术公开了一种Aβ1-42单体，所述的Aβ1-42单体主要为单体和少量寡聚体的混合物；所述单体经蛋白免疫印记法电泳鉴定：分子量为4-4.5KD；所述寡聚体经蛋白免疫印记法电泳鉴定：分子量为12-16KD，为三聚体和四聚体。还公开了所述Aβ1-42单体的制备方法及鉴定方法。本发明专利技术提供的Aβ1-42单体成分较单一、产物较稳定，在建立动物模型时，能将Aβ1-42单体作为对照组或实验组，从而对模型的评价更为客观与科学，为建立理想和可靠的AD模型提供良好的基础；其制备方法简单、收率高、省时；所采用的SDS-PAGE结合蛋白免疫印记鉴定方法，具有敏度高、特异性强、方便快速、操作简单、费用较低等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及β -淀粉样蛋白领域，具体涉及一种Αβ 1-42单体及其制备、鉴定方 法。
技术介绍
阿尔茨海默病（Alzheimer' S disease，AD)也称为老年痴呆症，是发生在老年期 或老年前期的一种慢性、持续性、退化性的脑变性疾病，其临床表现为记忆减退、认知障碍、 人格改变等。该病的病理特征主要包括大脑皮质和海马区域的细胞外出现以淀粉样蛋 白（beta-amyloid, Αβ)为核心的老年斑、细胞内神经原纤维缠结等病变。在美国AD是仅 次于心血管病、癌症和脑卒中的第四大死亡杀手，据统计目前全世界AD发病人数高达2500 万，我国AD患者已达到600余万，居世界首位，AD病程时间长且目前尚无彻底根治的药物， 它严重威胁着人类的健康，给患者及家属带来巨大的影响。因此建立理想及可靠的AD动物 模型，对于研宄和探讨AD的病因、病理过程以及寻找和筛选有效药物显得尤为重要。 Αβ是由淀粉样前体蛋白经β-和γ-分泌酶的蛋白水解作用而产生的含有39~ 43个氨基酸的多肽，A β的大量沉积，是导致AD病人脑内老年斑周边神经元变性和死亡的 主要原因。Αβ在脑内有多种存在形式，如：低分子量Αβ单体、Αβ寡聚体、不溶性Αβ纤 维体等。Αβ单体是可溶性的低分子物质，但是当胞内环境，如pH、温度、离子浓度、蛋白浓 度等改变时会诱发Αβ单体快速聚集，形成二聚体、三聚体或可溶性的Αβ寡聚体，Αβ寡 聚体的稳定性较差，易向Αβ纤维体转化。Αβ的种类分为Αβ 1-39、Αβ 1-40、Αβ 1-41、 Αβ 1-42和Αβ 1-43,其中Αβ 1-42的毒性最大，是AD的主要致病因素，因此，研宄Αβ 1-42 是当前的热点。 近年来，有科学家提出，Aβ纤维体与记忆损害及神经细胞缺乏的关系不大，推测 Αβ寡聚体、低分子量Αβ单体等可溶性Αβ可能是AD的致病因素。科学家们对Αβ 1-42 寡聚体做了很多研宄，在建立模型时一般普遍采用A β 1-42寡聚体直接注射方法，但目前 制备、合成Αβ 1-42的寡聚体均不稳定，体外容易随机形成各种高分子量或低分子量的混 合产物，这种组分不均一的复杂混合物直接影响到实验结果的准确性和可靠性，造成无法 区分是A β 1-42寡聚体（oligomers)抑或是A β 1-42寡聚体与单体（Monomers)的共同作 用。但现有技术对A β 1-42单体极少有报导，因此，制备成分较单一、稳定的A β 1-42单体， 可为AD的发病机制、病理过程、寻找和筛选有效药物提供有效依据。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新合成的A β 1-42单体及其制备、鉴定方法。本专利技术 提供的A β 1-42单体成分较单一、产物较稳定，在建立动物模型时，能将A β 1-42单体作为 对照组或实验组，从而对模型的评价更为客观与科学，为建立理想和可靠的AD模型提供良 好的基础；其制备方法简单、收率高、省时；所采用的SDS-PAGE结合蛋白免疫印记鉴定方 法，具有敏度高、特异性强、方便快速、操作简单、费用较低等优点。 本专利技术是通过以下技术方案实现的： -种A β 1-42单体，所述的A β 1-42单体主要为单体和少量寡聚体的混合物；所述 单体经蛋白免疫印记法电泳鉴定：分子量为4-4. 5KD ;所述寡聚体经蛋白免疫印记法电泳 鉴定：分子量为12-16KD，为三聚体和四聚体。 以上所述A β 1-42单体，所述的A β 1-42单体的制备方法为：取A β 1-42合成肽， 在室温下完全溶解在HFIP中，所得溶液转移到离心管中，用干浴氮吹仪使HFIP彻底吹干； 加入DMSO使离心管底部的固体完全溶解，再加入HEPES缓冲液，混匀；在温度为37°C条件 下震荡24小时，转速600转/分钟，即得。 以上所述Aβ 1-42单体的制备方法，包括以下步骤： 1.将Img的Αβ 1-42合成肽，加入220-225 μ L HFIP中，在室温下静置30-60分 钟，得到完全溶解的溶液； 2.将步骤1得到的溶液转移到硅化的离心管中，在干浴氮吹仪上吹8-15分钟，使 HFIP彻底吹干，得到透明片状固体沉于管底； 3.在所述离心管中加入40 μ I DMSO,使离心管底部的固体完全溶解，再加入pH值 为7. 4的浓度为IOmM HEPES缓冲溶液，使溶液最后终体积为lml，混合均匀； 4.将步骤3得到的溶液在温度为37°C条件下震荡24小时，转速600转/分钟，即 得。 一种以上所述A β 1-42单体的鉴定方法，包括以下步骤： I. SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳：取A β 1-42单体溶液2 μ L，与18 μ L 4Χ电泳上样缓 冲液混合均匀，然后上样，电泳上样量为5ul/泳道，电泳用的胶为4 - 12%的梯度胶，同时 在一个泳道加入10 μ L分子量为3. 6-260KD的预染分子量标准品，电泳时选择80V电压电 泳30-40分钟，然后转IOOv电压继续电泳2小时； 2.转膜：将电泳好的蛋白条带转移到PVDF膜上，半干法转膜，时间为6分钟，将 转好的PVDF膜按加样泳道的大小裁剪，然后将剪裁好PVDF膜浸泡到TBST溶液中5-10分 钟； 3.封闭：再将PVDF膜浸泡在含有5%脱脂奶粉的TBST溶液中，摇床上慢速振荡， 转速可为65-75转/分钟，室温条件下封闭1小时； 4.洗膜：将步骤3得到的PVDF膜浸泡在TBST溶液中，在摇床上震荡漂洗2-3次， 每次5分钟； 5. -抗孵育：将步骤4得到的PVDF膜浸泡在含有6Ε10的一抗溶液中，室温下孵 育1小时； 6.洗一抗膜：将经过一抗孵育的PVDF膜浸泡在TBST溶液中，在摇床上震荡漂洗6 次，每次5分钟； 7.二抗孵育：将漂洗好的PVDF膜浸泡在含有辣根过氧化物酶标记的二抗溶液中 室温下孵育1小时； 8.洗二抗膜：将经过二抗孵育的PVDF膜浸泡在TBST溶液中，在摇床上震荡漂洗6 次，每次5分钟； 9.化学发光曝光：将HRP底物液均匀加在经步骤8漂洗过的PVDF膜上，在5-30秒 内分别进行暗室曝光显影，从中选择条带清晰的胶片作为最后结果。 与现有技术相比，本专利技术取得的有益效果为： 1.本专利技术提供的A β 1-42单体成分较单一，主要含有分子量为4-4. 5KD的单体，纯 度为75%以上，另含有少量分子量为12-16KD的寡聚体；A β 1-42单体较稳定，4°C条件下， 其分子量在8小时内基本不变。在建立动物模型时，能将本专利技术Aβ 1-42单体作为对照组 或实验组，从而对模型的评价更为客观、科学，为建立理想和可靠的AD模型提供良好的物 质基础。 2.本专利技术Αβ 1-42单体的制备方法简单、收率高、省时、成本低；选用HEPES缓冲 溶液，能较长时间控制恒定的PH范围，与F12等缓冲液相比取得更好的缓冲效果。 3.采用SDS-PAGE结合蛋白免疫印记法鉴定本专利技术Αβ 1-42寡聚体，该方法不仅能 检测Αβ 1-42单体或寡聚体分子量的大小，同时还可以检验Αβ 1-42单体或寡聚体的纯度， 与酶联免疫吸附法、流式荧光技术、透射电子显微镜观察相比，具有敏度高、特异性强、方便 快速、操作简单、费用较低、图像清晰、结果准确等优点，克服了当前蛋白免疫印记法存在的 蛋白质本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种Aβ1‑42单体，其特征在于：所述的Aβ1‑42单体主要为单体和少量寡聚体的混合物；所述单体经蛋白免疫印记法电泳鉴定：分子量为4‑4.5KD；所述寡聚体经蛋白免疫印记法电泳鉴定：分子量为12‑16KD，为三聚体和四聚体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：岳峰，陆春玲，
申请(专利权)人：广西南宁灵康赛诺科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广西;45
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